Liposome脂質(zhì)體機(jī)器在化妝品體系中的表征

Liposome脂質(zhì)體機(jī)器在化妝品體系中的表征背景介紹

脂質(zhì)體(liposomes)：將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊。也稱類脂小球或液晶微囊。

脂質(zhì)體的概念磷脂親水的頭部磷酸骨架水溶性分子（膽堿、絲氨酸、季胺鹽等）疏水的尾部膽固醇脂質(zhì)體兩條脂肪酸鏈，（10-24個(gè)C原子，0-6個(gè)雙鍵）

磷脂結(jié)構(gòu)示意圖膽固醇的結(jié)構(gòu)圖脂質(zhì)體的組成雙分子結(jié)構(gòu)：磷脂分子的親水端呈彎曲的弧形，形似“手杖”，與膽固醇分子的親水基團(tuán)

相結(jié)合，形成“U”形結(jié)構(gòu)。兩個(gè)“U”形結(jié)構(gòu)相對(duì)排列，則形成雙分子結(jié)構(gòu)卵磷脂與膽固醇在脂質(zhì)體中的排列形式膽固醇與磷脂的排列示意圖脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)體形成示意圖脂質(zhì)體的形成LiposomesMicelles脂質(zhì)體與膠束的區(qū)別脂質(zhì)體膠束組成磷脂和膽固醇表面活性劑結(jié)構(gòu)雙分子層單分子層中心區(qū)域水相，可容納親水性藥物疏水區(qū)，可容納疏水性藥物脂質(zhì)體的分類單室脂質(zhì)體小單室SUV

20-100nm大單室LUV100-1000nm多室脂質(zhì)體MLV

1~5μm洋蔥式、管狀、球形、橢球形結(jié)構(gòu)和粒徑脂質(zhì)體的分類-結(jié)構(gòu)和粒徑多囊脂質(zhì)體MVV

1~5μm緩釋效應(yīng)和儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)洋蔥式管狀球形、橢球形多囊Akbarzadehetal.NanoscaleResearchLetters.2013,8:102脂質(zhì)體材料中性磷脂負(fù)電荷磷脂（酸性磷脂）正電荷脂質(zhì)膽固醇（Ch)大豆甾醇及其葡萄糖苷磷脂酰膽堿（PC）磷脂酰乙醇胺（PE）鞘磷脂（SM）磷脂酸（PA）磷脂酰甘油（PG）磷脂酰肌醇(PI)磷脂酰絲氨酸(PS)硬脂酰胺（SA）膽固醇衍生物大豆甾醇葡萄糖苷(SG）大豆甾醇SS脂質(zhì)體的材料不同材料，形成不同結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體⑴磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)脂質(zhì)體的材料-中性磷脂(a)全飽和磷脂

（緊密排列）(b)非飽和磷脂（不能緊密列）磷脂脂肪鏈的飽和度對(duì)磷脂膜排列的影響①天然的PCa.從蛋黃、大豆、牛心臟和脊髓提取b.每一種PC具有不同長(zhǎng)度、不同飽和度的脂肪鏈植物性PC的脂肪鏈具有高度不飽和性動(dòng)物性PC的脂肪鏈大部分是飽和的②合成的PC二棕櫚酰膽堿（DPPC)、

二硬脂酰膽堿(DSPC)二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿（DMPC)

特性：頭部基團(tuán)?。环秋柡偷腜E容易形成非雙層結(jié)構(gòu)型--六角相（制備特殊脂質(zhì)體）六角相磷脂酰乙醇胺（PE）脂質(zhì)體的材料-中性磷脂⑵磷脂酰乙醇胺(phosphatidethanolamine,PE)特性：酰胺鍵和羥基基團(tuán)之間形成氫鍵相互作用，因此，比PC具有更高秩序的膠相。SM脂質(zhì)體的材料-中性磷脂⑶鞘磷脂（sphingomyelin,SM）

磷脂酸(phosphatidicacid,PA)

磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)負(fù)電荷磷脂（酸性磷脂）脂質(zhì)體的材料-負(fù)電荷磷脂電荷增加脂質(zhì)體透皮吸收

磷脂酰胺(Stearamide,SA)

膽固醇衍生物CDBA和CTBBA脂質(zhì)體的材料-正電荷脂質(zhì)LiuXM,YangB,etc.BiochimBiophysActa,2005,1720(1-2),28-34.LiuXM,YangB,etc.ChemMater,2005,17(11),2792-2795.包裹物質(zhì)脂溶性藥物定位于雙分子層脂質(zhì)膜間兩性化合物定位于水相與膜內(nèi)部交界磷脂上水溶性藥物包裹在水相不能包裹物質(zhì)在水相和有機(jī)溶劑中都不溶的物質(zhì)

在兩種介質(zhì)中溶解性都非常好的物質(zhì)

脂質(zhì)體的包裹作用機(jī)理單室脂質(zhì)體多室脂質(zhì)體脂質(zhì)體與細(xì)胞的相互作用：吸附、脂交換、內(nèi)吞、融合脂質(zhì)體與細(xì)胞的相互作用在護(hù)膚品領(lǐng)域，一般是指用卵磷脂類形成雙分子層微囊，把需要被皮膚吸收利用的原料包裹在其中；將對(duì)皮膚有養(yǎng)護(hù)作用的原料，用卵磷脂包裹后，有這樣幾個(gè)好處：提高吸收效率脂質(zhì)體細(xì)胞膜的磷脂雙分子層的結(jié)構(gòu)非常接近，提高脂質(zhì)體的經(jīng)皮吸收效率。對(duì)被包裹物質(zhì)提供保護(hù)脂質(zhì)體可以將油性原料分散在親油層中，也可以將水性原料包裹在脂質(zhì)體球心。而磷脂則可以將有效成分與空氣隔離開(kāi)，使有效成分更長(zhǎng)久的保存，延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期，也可以延長(zhǎng)涂抹在皮膚上后的有效時(shí)間。降低配方難度由于卵磷脂獨(dú)特的親油親水性，脂質(zhì)體可以隨意分散在水中，不增加乳化工作。脂質(zhì)體作為化妝品載體的應(yīng)用原理亮劍之旅拓展訓(xùn)練課程磷脂藥物復(fù)合物磷脂凝膠脂質(zhì)體前體化妝品領(lǐng)域衍生的脂質(zhì)體類型脂質(zhì)體

形式柔性脂質(zhì)體角質(zhì)脂質(zhì)體醇質(zhì)體脂質(zhì)體變換形式化妝品：脂質(zhì)體的透皮吸收和緩釋作用是重點(diǎn)，修復(fù)性，保護(hù)性，增效性膏霜類化妝品一般加多室或多囊脂質(zhì)體脂質(zhì)體的理化性質(zhì)相變溫度(phasetransitiontemperature,Tc)

脂質(zhì)體升高溫度至一定溫度膜的物理性質(zhì)改變膜的橫切面增加、雙分子層厚度減少、膜流動(dòng)性增加

脂質(zhì)雙分子層中酰基側(cè)鏈排列改變

有序排列變?yōu)闊o(wú)序排列

相變溫度Tc脂質(zhì)體的理化性質(zhì)—相變溫度TcTc以下時(shí)，為“膠晶態(tài)”（脂肪鏈全反式，排列緊密，剛性和厚度增加）Tc以上時(shí)，為“液晶態(tài)”（脂肪鏈伸縮、彎曲、外扭）磷脂發(fā)生相變時(shí)，“膠晶態(tài)”“液晶態(tài)”“液態(tài)”共存，出現(xiàn)相分離，使膜的流動(dòng)性增加，易導(dǎo)致內(nèi)容物泄漏。相變溫度與脂質(zhì)體膜穩(wěn)定性脂質(zhì)體的理化性質(zhì)—相變溫度Tc脂質(zhì)體應(yīng)用的局限性—穩(wěn)定性形貌粒度Zeta電位包封率磷脂含量脂質(zhì)體表征電鏡法常規(guī)電鏡法Fig1脂質(zhì)體的TEM測(cè)試項(xiàng)目樣品制備缺點(diǎn)局限性常規(guī)TEM1.樣品一般需要使用磷鎢酸染色（負(fù)染）2.將樣品用稀釋到合適的濃度，1Wt%左右3.用毛細(xì)管滴到銅網(wǎng)上，晾干或烘干1.脂質(zhì)體干燥過(guò)程中會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。2.對(duì)小顆粒分辨率不高。100nm左右。常規(guī)SEM1.將含有脂質(zhì)體的樣品滴在干凈的硅片上面2.晾干或者烘干3.對(duì)其進(jìn)行噴金處理（增強(qiáng)樣品的導(dǎo)電性）1.只能看表面結(jié)構(gòu)，不能區(qū)分脂質(zhì)體和其它納米顆粒2.脂質(zhì)體不導(dǎo)電，需要噴金處理。AFM1.把樣品稀釋為濃度1Wt%左右2.樣品滴在云母片上3.放置待溶劑揮發(fā)干后進(jìn)行測(cè)試只能看表面結(jié)構(gòu)，X,Y軸不靈敏，分辨率低探針難控制Fig1脂質(zhì)體的TEMFig3脂質(zhì)體的AFMFig2脂質(zhì)體的SEM常規(guī)電鏡法缺點(diǎn)：1.樣品干燥后失去原貌2.分辨率不高，不能區(qū)分脂質(zhì)體和其他納米顆粒。AlineFXavier,DaianaKDeda2,,etal.IJABPT,2016,7(2),303-313RuanLP,ZhangHY,LuoHL,etal.ScienceinChinaSeriesB:Chemistry,2009方案一：冷凍制樣及掃描電鏡傳輸系統(tǒng)(Cryo-SEM)低溫掃描電鏡樣品制備及觀測(cè)過(guò)程樣品獨(dú)立制備與分析：鍍膜儀真空鍍膜后保持真空狀態(tài)轉(zhuǎn)移到SEM，在制備與分析之間無(wú)污染樣品轉(zhuǎn)移。保留樣品原貌分辨率較高優(yōu)勢(shì)缺點(diǎn)：只能觀測(cè)表面結(jié)構(gòu)Cryo-TEM方案二：冷凍制樣及透射電鏡傳輸系統(tǒng)(Cryo-TEM)低溫透射電鏡樣品制備及觀測(cè)過(guò)程高壓冷凍儀可與超薄切片機(jī)及冷凍樣品桿配合，進(jìn)行低溫透射電鏡觀測(cè)測(cè)試方法：將蘸在銅網(wǎng)上的樣品溶液或分散液的液膜

急速冷凍，即在銅網(wǎng)上形成玻璃態(tài)水膜，

無(wú)冰晶產(chǎn)生。在樣品傳輸、進(jìn)樣、TEM觀察的過(guò)程中始終

保持低溫。

對(duì)于囊泡類樣品的觀察，通常使用這種方法。保留樣品原貌分辨率較高優(yōu)勢(shì)可觀測(cè)不同類型的脂質(zhì)體內(nèi)部結(jié)構(gòu)+方案二：冷凍制樣及透射電鏡傳輸系統(tǒng)(Cryo-TEM)外部資源：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所同濟(jì)大學(xué)SugikawaKetal.AngewandteChemieInternationalEdition,2016.JonasGustafssonetal.BiochimicaetBiophysicaActa1995方案三：類細(xì)胞切片制樣+常規(guī)電鏡技術(shù)SEM&TEM類冷凍切片制樣法：類似冷凍切片與細(xì)胞切片制備的方法，對(duì)化妝品樣品進(jìn)行固定包埋（石蠟包埋），然后進(jìn)行切片，然后將其放在銅網(wǎng)或硅片上進(jìn)行制樣，對(duì)脂質(zhì)體成像。分辨率能達(dá)到納米級(jí)別細(xì)胞切片法常常用來(lái)區(qū)分亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)樣品制備簡(jiǎn)單，成本低，資源廣脂質(zhì)體的形貌大小的表征獨(dú)創(chuàng)的方法ACSappliedmaterials&interfaces,2015,7(14):7526-7533.YigongShial.Structureofayeastspliceosomeat3.6-angstromresolution[J].Science,2015,349(6253):1182-1191.方案四：高分辨冷凍透射電鏡(HR-Cryo-TEM)2013年，冷凍電鏡技術(shù)在照相技術(shù)和軟件分析的圖像處理技術(shù)方面取得突破性進(jìn)展成為施一公實(shí)驗(yàn)室諾獎(jiǎng)級(jí)工作-剪切體的結(jié)構(gòu)解析的關(guān)鍵性工具HR-Cryo-TEM諾貝爾獎(jiǎng)熱門2014年全球科技十大進(jìn)展結(jié)構(gòu)生物學(xué)的突破性工具最高分辨率達(dá)2.2?優(yōu)勢(shì)區(qū)分不同結(jié)構(gòu)和類型的蛋白質(zhì)分辨率達(dá)到原子水平SCIENCE

348

1147-1151

(2015)FEBSJournal280(2013)28–45區(qū)分不同結(jié)構(gòu)和類型的脂質(zhì)體方案四：超高分辨冷凍透射電鏡(HR-Cryo-TEM)局限性：外部資源少國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心-上海脂質(zhì)體表征熒光法方案五：膽固醇熒光標(biāo)記+熒光共聚焦顯微鏡膽固醇與脂質(zhì)體異性結(jié)合，對(duì)膽固醇進(jìn)行熒光修飾，通過(guò)confocal觀測(cè)熒光脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)缺點(diǎn)：分辨率較低，可能無(wú)法達(dá)到幾十納米級(jí)別超高分辨率熒光顯微鏡優(yōu)點(diǎn)：專屬性，排除其他物質(zhì)干擾，外部資源多

SungTCetal.Scientificreports,2016,6.ShiXetal.PolymerChemistry,2013方案五：膽固醇熒光標(biāo)記+熒光共聚焦顯微鏡超高分辨率熒光顯微鏡（分辨率達(dá)到分子級(jí)別1nm左右，2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）STORM技術(shù)的開(kāi)創(chuàng)者莊小威2014諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)方案六：膽固醇熒光標(biāo)記+超高分辨熒光顯微技術(shù)StefanW.HellW.E.MoernerEricBetzigX.Zhuang，Science3171749-1753(2007)

NatureMethods3793-795(2006)

Science319810-813(2008)

低分辨熒光顯微鏡和超高分辨熒光顯微鏡圖片的對(duì)比局限性：外部資源少方案六：膽固醇熒光標(biāo)記+超高分辨熒光顯微技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：突破光學(xué)極限的分辨率：1nm左右，具有專屬性，可作為通用的方法北大工學(xué)院席鵬課題組上海交大李小衛(wèi)課題組SeeingisBelieving

分辨率非常重要大小形貌結(jié)構(gòu)Conclusion:化妝品終體系中脂質(zhì)體的表征方案一、假設(shè)脂質(zhì)體加入化妝品體系之后仍然穩(wěn)定存在，則使用Cryo-TEM或者切片法檢測(cè)，這兩種方法保留了脂質(zhì)體的原貌，理論上可以分辨出脂質(zhì)體的雙層結(jié)構(gòu)。受配方體系中其他添加劑的影響不大，而且對(duì)體系純度要求不高。二、對(duì)于一些特例。比如低倍的Cyro-TEM或者切片法觀測(cè)不到脂質(zhì)體,不確定是否穩(wěn)定存在于體系中，可以嘗試使用熒光法。該方法對(duì)樣品純度沒(méi)有要求。如果在共聚焦顯微鏡不能看到完整的脂質(zhì)體形狀，說(shuō)明脂質(zhì)體極大可能已經(jīng)被破壞，那么這樣的脂質(zhì)體在體系中發(fā)揮不了增溶的作用，已經(jīng)沒(méi)有太大的實(shí)用價(jià)值。三、如果在共聚焦顯微鏡下可以看到完整的脂質(zhì)體形狀，可以進(jìn)一步嘗試高分辨Cryo-TEM或者超高分辨熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。對(duì)于復(fù)雜樣品體系，需要多種表征方法一起反復(fù)確認(rèn)，以保證觀測(cè)結(jié)果的可靠性。激光粒度儀DLS脂質(zhì)體表征激光粒度掃描儀--水合粒徑原理：在不同的角度上測(cè)量散射光的強(qiáng)度，得到樣品粒度分布體積分布與數(shù)量分布之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系顆粒平均粒徑表示方法

體積（D4,3）表面積（D3,2）數(shù)量不同顆粒均值對(duì)顆粒分布的

不同特征敏感脂質(zhì)體的水合粒徑表征，應(yīng)根據(jù)具體的樣品體系選擇合適的表示方法激光粒度掃描儀--水合粒徑包封率脂質(zhì)體表征脂質(zhì)體的包封率測(cè)定

方法原理特點(diǎn)與適用范圍缺點(diǎn)HPLC法參照磷脂含量測(cè)定適用范圍廣，可同時(shí)用于磷脂含量和包封率測(cè)定/透析法利用半透膜分子大小差別，通過(guò)及時(shí)更換外相達(dá)到分離的目的簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，可處理大量樣品，適合小粒徑，穩(wěn)定性好的脂質(zhì)體耗時(shí)較長(zhǎng)，所耗介質(zhì)較多微柱離心法利用游離藥物與含藥脂質(zhì)體的重力差異進(jìn)行分離，計(jì)算包封率所需樣品少，適用于水溶性和脂溶性藥物，分離時(shí)間短，可用于中間過(guò)程檢測(cè)離心時(shí)間長(zhǎng)1h以上；重現(xiàn)性差；離心力導(dǎo)致脂質(zhì)體中物質(zhì)滲漏凝膠柱層析法利用脂質(zhì)體與游離藥物分子質(zhì)量和粒徑大小的差異進(jìn)行分離適用于脂溶性藥物，較大脂質(zhì)體粒徑（＞200nm）所需樣品量大，操