GBT 33526-2017 轉基因植物產品數字PCR檢測方法

ICS07.080GB/T33526—2017轉基因植物產品數字PCR檢測方法中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局IGB/T33526—2017本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由全國生化檢測標準化技術委員會(SAC/TC387)提出并歸口。1GB/T33526—2017轉基因植物產品數字PCR檢測方法本標準規(guī)定了轉基因成分檢測的數字PCR方法。PCR檢測。本標準所能達到的檢測低限為0.1%(質量分數)。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T19495.1轉基因產品檢測通用要求和定義GB/T19495.3轉基因產品檢測核酸提取純化方法GB/T19495.7轉基因產品檢測抽樣和制樣方法3.1轉錄自18srDNA,是細胞核糖體的組分之一。3.2CaMV35s啟動子基因CaMV35spro來自花椰菜花葉病毒(Cauliflowermosaicvirus,CaMV)的35s啟動子。3.3來自胭脂堿合成酶基因NOS的終止子。4原理數字PCR其技術原理是通過將原始PCR反應體系進行分割，進而對所有小的反應體系進行擴增現階段數字PCR的實現形式包括芯片式數字PCR與微滴式數字PCR兩種。其中芯片式數字這種分割方式的實驗成本相對較高；微滴式數字PCR平臺通過產生微小油包水體系實現反應體系的分2GB/T33526—2017本標準針對通用篩選元件CaMV35s啟動子和NOS終止子設計選取特異性引物和探針進行數字18s-F:5'-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3'18s-R:5'-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3′18s-P:5'-VIC-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-BHQ1-3′p35s-F:5'-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3′p35s-R:5'-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3'p35s-P:5'-VIC-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ1-3′TNOS-F:5'-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3'TNOS-R:5'-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3'TNOS-P:5'-VIC-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1-3'6.3數字PCR擴增儀。3GB/T33526—20176.9不同量程移液器以及配套吸頭如下：按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的規(guī)定執(zhí)行。按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的規(guī)定執(zhí)行。7.4DNA模板制備按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的規(guī)定執(zhí)行。7.5.1試樣數字PCR反應每個試樣內標準基因數字PCR反應設置3個平行。并按照表1的組分和終濃度配置數字PCR反應體系。反應體系配置完成后，進行反應體系的分割，其中芯片法數字PCR通過微流控芯片實現本步驟，微滴法數字PCR通過形成油包水結構實現體系的分割。該步驟按照不同數字PCR平臺的說明書進行操作。數字PCR反應的有效分割體系數不得低于理論分割體系數的60%。試劑終濃度體系2×反應Mix"20μmol/LzSSIIb-F/p35s-F/TNOS-F20μmol/LzSSIIb-R/p35s-R/TNOS-R20μmol/LzSSIIb-P/p35s-P/TNOS-P50ng/μLDNA模板12.5ng/μL水總體系推薦市面上現售的數字PCR平臺進行實驗，并針對市面上現售的不同數字PCR平臺，依據說明書調整反應體系的組分和最終體積，并保證表中所列組分的終濃度不變。4GB/T33526—2017體系分割完成后，進行數字PCR反應。熒光分析步驟采用VIC單熒光通道，反應程序如表2表2數字PCR反應程序步驟溫度持續(xù)時間循環(huán)數熱激活50℃1變性退火延伸60℃注：不同PCR反應平臺可以根據說明書對熱啟動步驟程序進行修改，但是不能對擴增程序進行修改。每個試樣外源基因數字PCR反應設置3個平行。外源基因擴增所用反應體系與反應程序與7.5.1.1相同，擴增所使用的引物探針為5.4與5.5所述引物探針。7.5.2對照數字PCR反應根據數字PCR結果中擴增曲線的基線或者體系中陰性分割體系的終點熒光值設定熒光的閾值限。閾值限需要對陰性和陽性擴增結果進行明顯的區(qū)分。陰性對照組只有內標準基因的擴增，空白對照組沒有任何擴增現象，這表明數字PCR反應體系正8.3.1內標準基因得到了明顯的擴增，并且外源p-35s或NOS基因的任何一個出現明顯的擴增現象，陽性擴增體系內擴增曲線形狀良好或者其終點熒光信號值超過熒光閾值，這表明試樣中檢測出了p-35s8.3.2內標準基因得到了明顯的擴增，且其擴增曲線形狀良好并超過閾值限，而p-35s或T-NO