GBT 35912-2018 豬繁殖與呼吸綜合征病毒 熒光RT-PCR檢測方法

熒光RT-PCR檢測方法中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局I125耗材5.11.5mL無RNA酶離心管。5.20.2mLPCR薄壁管或八聯(lián)管。6試劑6.1除非另有說明，在檢測中使用的試劑均為分析純，實驗室用水應符合GB/T6682的要求。6.2Trizol,商品化RNA抽提試劑，4C～8℃保存。6.5無水乙醇：-20C預冷6.675%乙醇：無水乙醇和雙蒸水配制，-20℃預冷。6.7DEPC水：配制見A.1,也可購買商品化DEPC水。6.8PBS:配制見A.2。6.9Taq酶及10倍Tag酶反應緩沖液：Tag酶濃度為5U/pL,Taq酶反應緩沖液中Mg2+濃度6.10逆轉(zhuǎn)錄酶及10倍逆轉(zhuǎn)錄酶反應緩沖液：逆轉(zhuǎn)錄酶濃度為-50UpL,20℃保存，避免反復凍融。6.11RNA酶抑制劑(40Up);-20℃保存避免反復東融。6.14豬繁殖與呼吸道綜合征病毒陽性對照樣品和陰性對照樣品，陽性對照為非感染性體外轉(zhuǎn)錄RNA;陰性對照為健康豬的組織材料。6.15內(nèi)參照質(zhì)粒帶有人β珠蛋白基因的質(zhì)粒7樣品采集和處理7.1采樣工具7.1.1手術刀、剪刀、鑷子，經(jīng)160C于熱滅菌2h。7.1.2注射器。7.1.3一次性無菌采樣拭子。7.1.4組織研磨器或者研缽，經(jīng)160℃干熱滅菌2h。7.1.5真空采血管。7.2樣品采集7.2.1血清樣品采集：用無菌注射器抽取受檢豬靜脈血不少于5mL,置于無菌離心管內(nèi)，室溫或者37℃傾斜放置自然凝集20min～30min,2000r/min～3000r/min離心10min,吸取上清液到新的離7.2.2公豬精液：按照GB/T25172的方法采集和保存精液。7.2.3口腔拭子：大豬使用保定器保定，小豬可以雙手保定，用采樣拭子蘸取口腔分泌物，放入無菌采7.2.4肺灌洗液：完整摘取肺臟/肺葉，送實驗室進37.2.6細胞培養(yǎng)物：細胞培養(yǎng)物反復凍融3次，第3次解凍后，將細胞培養(yǎng)物置于1.5mL無RNA酶的滅菌離心管內(nèi)，編號備用。7.3.1上述采集的樣品可立即用于檢測。不能立即檢測的樣品，在2℃~8℃下保存應不超過24h,-20℃±5℃下應不超過3個月，-70℃以下可長期保存。樣品運送采用低溫保存進行運輸，并在規(guī)定溫度下的保存期內(nèi)送達。7.4.1血清和精液樣品無需進行前處理，直接用手核酸提取7.4.2口腔拭子樣品：加人500無菌PBS,充分渦旋震蕩Fmin,反復擠壓拭子，棄去拭子后3000r/min離心5min,取上清用于后續(xù)的核酸提取。7.4.3肺灌洗液：根據(jù)肺臟/肺葉的大小，通過肺管加入5mL～10mL無菌PBS,反復揉捏，吸取灌洗液，3000r/min離心5min,取上清用于核酸提取。7.4.4組織樣品：取1g組織，剪碎，加入2mL生理鹽水進行研磨，制備組織勻漿，8000r/min離心5min,取上清用于后續(xù)的核酸提取7.4.5細胞培養(yǎng)物：4000r/min,TC離心10-mn,取上清用于后續(xù)的核酸提取8熒光RT-PCR操作程序8.1RNA抽提8.1.1在核酸提取區(qū)操作。RNA抽提使用Trizl手工提取，也可以使用等效的商品化試劑盒。8.1.2取n個滅菌的1.5mL無RNA酶離心管，其中n為待檢樣品數(shù)干陽性對照+陰性對照，對每個離心管進行編號。8.1.3每管先加入600uLTrizol裂解液，再分別加入被檢樣品、陽性對照、陰性對照各200μL,顛倒10次混勻，最后加入200L氯仿，渦旋震蕩5s,4℃條件下12000r/min離心15min。8.1.4將上層透明液體(約400μL)轉(zhuǎn)移到一個新的無RNA酶的離心管中，加入等體積預冷的異丙醇，每個離心管對應編號。8.1.512000r/min離心15min,棄去上清，沿管壁緩緩加入0.8mL～1ml75%乙醇，顛倒3～6次混勻，12000r/min離心10min。反復洗滌兩次后，將離心管倒扣于吸水紙上，自然晾干或用移液器移去殘液。8.1.6加入20μLDEPC水，輕輕混勻，溶解RNA。提取的RNA應盡快進行反轉(zhuǎn)錄擴增或放置于8.1.7提取過程中要注意交叉污染，移液過程每份樣品都需要更換吸頭；不同樣品離心管倒扣在吸水紙上的不同位置。8.2熒光PCR檢測8.2.1反應體系的配制在試劑配制區(qū)進行。設實時熒光PCR反應管數(shù)為n,n為待檢樣品數(shù)+陽性管數(shù)+陰性管數(shù)，每個反應的體系見附錄C,為了避免移液器取樣損失，建議按n+1個反應進行配制。配制反應液在冰盒49.3.4被檢樣本檢測結(jié)果中FAM通道和HEX通道均無Ct值或無典型的S型擴增曲線，同時ROX5溶液配制6引物和探針名稱序列M-P(探針)5'-FAM-CTGGCCCCTGCCNSP2-P(探針)5'-HEX-ACGCTGACGCACCAGGATGAIC-P2(探針)5'