(高清版)GB∕T 38740-2020 實驗動物 猴馬爾堡病毒檢測方法

GB/T38740—2020Laboratoryanimal—MethodforexaminationofsimianMarburg國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會Ⅰ本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由全國實驗動物標準化技術委員會(SAC/TC281)提出并歸口。本標準起草單位：海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心、中華人民共和國福州海關、中華人民共和國成都海關、中華人民共和國?？诤ｊP、中華人民共和國濟南海關、北京腦科學與類腦研究中心、中華人民共和國?？诤ｊP、中華人民共和國昆明海關。本標準主要起草人：李丹丹、張體銀、安微、王綏家、凌宗帥、李文龍、陳平亞、艾軍。實驗動物猴馬爾堡病毒檢測方法本標準規(guī)定了猴馬爾堡病毒實時熒光RTPCR檢測的操作方法。本標準適用于猴馬爾堡病毒的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T18088出入境動物檢疫采樣GB19489實驗室生物安全通用要求3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1最大的負鏈RNA病毒。3.2犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲狉犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲物的同時加入一條特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸片段，兩端分別標記一個報告熒光基團和一到熒光信號，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。3.3熒光PCR儀在僅僅使用PCR管和水的狀態(tài)下的本底熒光強度。3.4從基線到指數(shù)增長的拐點所對應的PCR反應循環(huán)次數(shù)。4縮略語下列縮略語適用于本文件。12RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)5試劑或材料本標準所用水應符合GB/T6682中一級水的規(guī)格要求。5.3異丙醇：-20℃預冷。5.3異丙醇：-20℃預冷。5.4磷酸鹽緩沖液(PBS)：見附錄A中的A.1。5.5無RNase水：見A.2。5.675%乙醇：見A.3。5.9dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L。5.12RNA酶抑制劑。5.13陽性對照：體外轉(zhuǎn)錄的、非感染性的、猴馬爾堡病毒陽性RNA片段，DNA序列參見附錄B。5.14陰性組織對照：猴馬爾堡病毒陰性組織樣品。上游引物MARVF:5′TTGGTGCGGACCTCCAAAGT3′;下游引物MARVR:5′GCGCAATTGCTGAGAGCTGA3′;探針：5′FAMAGCAGGCGTTGAGCAACCTAGCCCGABHQ13′。6儀器設備6.1熒光定量PCR核酸擴增儀。6.2生物安全柜。6.3電子天平。6.4高速冷凍離心機，臺式離心機。6.5冷藏冷凍冰箱。6.6組織勻漿器。6.7旋渦振蕩器。7樣品采集樣品的采集、保存及運輸過程中應做好相關人員生物安全保護，并符合GB/T18088的相關要求。樣品的處理應在具有生物安全3級條件的實驗室中進行，實驗室條件符合GB19489要求。7.2取樣工具棉拭子、剪刀、鑷子、離心管、一次性無菌注射器，上述取樣工具應無菌。7.4肛拭子或者糞便7.6存放和運送反復凍融（最多凍融3次）。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，盡快運送到實驗室。8試驗步驟8.1實驗室生物安全要求病原樣本的檢測應在生物安全3級條件的實驗室中進行，實驗室條件符合GB19489要求。8.2樣本核酸提取8.2.1在樣本處理區(qū)進行。為防止RNA降解，所用試驗用具及溶液應無RNA酶，操作過程中應佩戴一次性橡膠或乳膠手套。15min。34勻，室溫放置10min。10min。箱保存?zhèn)溆谩?.2.9在實驗過程中，同時設置陰性對照和以DEPC水空白對照。8.2.10可采用同等效果的商業(yè)化RNA抽提試劑盒代替以上方法。實時熒光PCR擴增可以采用等效的商品化熒光定量PCR試劑盒。8.5.1結果分析條件設定綜合分析儀器給出的各項結果，基線以儀器給出的默認值作為參考，閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點為準，具體根據(jù)儀器噪音情況進行調(diào)整，選擇FAM通道進行分析。二者均成立才可判定試驗成立。8.5.3結果描述及判定定MARV陽性；否則判定MARV陰性。5（規(guī)范性附錄）試劑配方室溫保存。超純水mL焦炭酸二乙酯(DEPC)mL室溫過夜，121℃,15min滅菌，或直接購買無RNase超純水。無水乙醇無RNase超純水現(xiàn)配現(xiàn)用。2mLmL6（資料性附錄）參考序列ttggtgcggacctccaaagtaaaa