(高清版)GB∕T 38580-2020 微生物誘變育種技術(shù)規(guī)范

ICS07.080A21中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物誘變育種技術(shù)規(guī)范T國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)ⅠGB／T38580—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：清華大學(xué)、洛陽(yáng)華清天木生物科技有限公司、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張罛、邢新會(huì)、李梅、剪興金、王立言、郭肖杰、張樂樂、馬愛進(jìn)。1GB／T38580—2020微生物誘變育種技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物誘變育種要求和證實(shí)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于細(xì)菌、放線菌、酵母和霉菌等微生物的紫外、等離子體和化學(xué)誘變育種。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB15193.19食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)致突變物、致畸物和致癌物的處理方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1面向工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等用途，在發(fā)酵過程中發(fā)揮生理代謝作用的微生物。3.2通過人為的措施誘導(dǎo)遺傳物質(zhì)產(chǎn)生突變的方法。3.3以人工誘變手段誘發(fā)微生物遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，并從突變?nèi)后w中篩選出所需要的突變株，進(jìn)而培育成新品種的育種方法。試驗(yàn)人員應(yīng)熟悉基本微生物操作，在開展相關(guān)試驗(yàn)前應(yīng)充分了解使用微生物、誘變劑存在的風(fēng)險(xiǎn)和安全操作規(guī)范，試驗(yàn)過程中做好相應(yīng)防護(hù)。4.2設(shè)施與環(huán)境具有能開展基本微生物試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室或車間，配備相關(guān)水、電、氣等基礎(chǔ)設(shè)施；實(shí)驗(yàn)室生物安全等級(jí)需滿足所誘變微生物的要求。誘變材料應(yīng)遵循以下原則：2GB／T38580—2020將菌種接種至合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗滌兩次，再用將菌種接種至固體平板或斜面上培養(yǎng)至產(chǎn)生大量孢子；用生理鹽水洗脫并離心收集。用生理鹽水洗滌兩次，再用適量生理鹽水重懸并通過機(jī)械振蕩使其充分分散；過濾除掉菌絲體。最后用生理鹽水懸將菌種接種到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至產(chǎn)生大量生長(zhǎng)旺盛的菌絲，取一定量菌液并離心收集。用生理鹽水洗滌兩次，再用適量生理鹽水重懸并通過機(jī)械振蕩使菌絲斷裂，過濾除去未斷裂的菌絲。最后用4.3.5原生質(zhì)體懸浮液將菌種接種到合適的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)獲得大量新鮮菌絲或孢子，收集菌絲或孢子。用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌兩次并重懸，向重懸液中加入一定量破壁酶，在最適條件下酶解，定時(shí)取樣于顯微鏡下觀察原生質(zhì)體釋放情況。酶解完成后過濾除去未酶解的菌絲，離心收集原生質(zhì)體，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌原生質(zhì)體三4.4誘變育種操作紫外誘變育種操作要求如下：參數(shù)。至產(chǎn)生單菌落。4.4.2常壓室溫等離子體誘變常壓室溫等離子體誘變育種操作要求如下：GB／T38580—2020生單菌落?；瘜W(xué)誘變要求如下：其配制方法參見附錄A和附錄B。C。入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，離心，棄掉上清，用無(wú)菌去離子水洗滌誘變處理過的菌體。無(wú)菌水代替。生單菌落。5證實(shí)方法誘變結(jié)果以致死率表示，致死率按式（1）計(jì)算：式中：LR—致死率；CC—陰性對(duì)照平板菌落數(shù)；CT—試驗(yàn)組平板菌落數(shù)。34GB／T38580—2020附錄A（資料性附錄）化學(xué)誘變劑種類、作用機(jī)制及常用化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑的種類、作用機(jī)制及常用化學(xué)誘變劑見表A.1。表A.1化學(xué)誘變劑種類作用機(jī)制常用誘變劑堿基類似物代替DNA中的正常堿基5-溴尿嘧啶(5-BU)5-氟尿嘧啶(5-FU)6-氮雜尿嘧啶(6-NU)2-氨基嘌呤(2-AP)6-巰基嘌呤(6-MP)8-氮鳥嘌呤(8-NG)烷化劑對(duì)DNA分子中堿基的烷基化修飾亞硝基乙基脲亞硝基胍硫酸二乙酯硫酸（磺酸）酯類甲基磺酸甲酯甲基磺酸乙酯移碼誘變劑移碼突變吖啶橙原黃素氧化類誘變劑DNA堿基氧化損傷亞硝酸（及其鹽）金屬離子機(jī)制尚不清楚錳離子5GB／T38580—2020附錄B（資料性附錄）常用化學(xué)誘變劑配制方法B.1亞硝基胍（NTG）配制方法如下：·菌水中，過濾除菌。B.2亞硝酸鈉（NIT）配制方法如下：B.3硫酸二乙酯（DES）配制方法如下：B.4甲基磺酸乙酯（EMS）配制方法如下：過濾，121℃滅菌15min或115℃滅菌30min;6GB／T38580—2020附錄C（資料性附錄）常用化學(xué)誘變劑誘變條件及致死率常用化學(xué)誘變劑誘變條件及致死率見表C.1。表C.1誘變劑工作濃度誘變菌種誘變時(shí)間致死率誘變溫度亞硝酸鈉(NIT)產(chǎn)小檗堿內(nèi)生真菌菌絲懸液綠色木霉孢子懸液室溫茂源鏈霉菌孢子懸液粘帚霉菌孢子懸液白腐真菌孢子懸液10min~20min85%~95%25℃~26℃平貝母內(nèi)生真菌菌絲懸液室溫蠟狀芽孢桿菌菌懸液亞硝基胍(NTG)茂源鏈霉菌孢子懸液蠟狀芽孢桿菌菌懸液枯草芽孢桿菌菌懸液植物乳桿菌菌懸液放線菌孢子懸液硫酸二乙酯(DES)1%粗壯脈紋孢菌孢子懸液>99%1%綠色木霉孢子懸液山東鏈霉菌菌懸液100%GB／T38580—2020表C.1（