AbMole 類器官與CRISPR技術(shù)揭示脂肪變性機(jī)制開啟NAFLD治療新篇章

AbMole|類器官與CRISPR技術(shù)揭示脂肪變性機(jī)制，開啟NAFLD治療新篇章由DelilahHendriks,JosFBrouwers,KarienHamer等人在“NatureBiotechnology”上發(fā)表的名為“EngineeredhumanhepatocyteorganoidsenableCRISPR-basedtargetdiscoveryanddrugscreeningforsteatosis”的文章，在該文章中，使用了AbMole的Y-27632（M1817）抑制劑。非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）已成為全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，影響著超過25%的全球人口。作為一種多因素疾病，NAFLD不僅與不良的生活方式和飲食習(xí)慣密切相關(guān)，還受到遺傳因素的顯著影響。然而，由于缺乏適合人類生理特性的模型系統(tǒng)，針對NAFLD的有效治療藥物開發(fā)進(jìn)展緩慢。近期，一項(xiàng)由DelilahHendriks及其同事在《NatureBiotechnology》上發(fā)表的研究，通過構(gòu)建人類胎兒肝細(xì)胞類器官模型，為揭示NAFLD早期階段——脂肪變性（steatosis）的分子機(jī)制和潛在治療靶點(diǎn)開辟了新的途徑。研究首先構(gòu)建了一個基于外源性游離脂肪酸（FFA）加載的脂肪變性模型。通過將野生型（WT）類器官暴露于油酸和棕櫚酸的混合溶液中，研究人員成功模擬了西方飲食對肝臟的影響。隨著FFA濃度的增加，類器官內(nèi)脂質(zhì)滴的積累逐漸增多，最高濃度處理下脂質(zhì)覆蓋率超過40%（圖1b,c）。同時(shí)，F(xiàn)FA處理還顯著抑制了類器官的增殖能力，表現(xiàn)為Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)量的急劇減少（補(bǔ)充圖2a,b），這可能與某些脂肪酸（特別是棕櫚酸）的脂毒性有關(guān)。為了探究遺傳因素在脂肪變性中的作用，研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR技術(shù)引入了PNPLA3基因的I148M變異，該變異是迄今為止已知的最強(qiáng)NAFLD遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素之一。通過基因編輯，研究人員成功構(gòu)建了PNPLA3WT、PNPLA3WT/I148M雜合子以及PNPLA3I148M/I148M純合子類器官模型。結(jié)果顯示，PNPLA3基因的不同變異形式對類器官中脂質(zhì)水平的影響存在顯著差異，純合子變異型類器官的脂肪變性程度最高，其次是雜合子變異型，而野生型類器官在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下幾乎不積累脂質(zhì)（圖1d,e,f）。此外，研究人員還觀察到PNPLA3蛋白在純合子變異型類器官的脂質(zhì)滴上顯著富集，這可能與I148M變異增加脂肪變性的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)（圖1g）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PNPLA3基因變異不僅影響類器官的脂質(zhì)水平，還改變了它們對FFA挑戰(zhàn)的反應(yīng)性。與野生型類器官相比，攜帶PNPLA3I148M變異的類器官在輕度FFA挑戰(zhàn)下表現(xiàn)出更嚴(yán)重的脂肪變性（圖1h,i,j）。圖1：人類胎兒肝細(xì)胞類器官中的精確基因編輯評估了脂肪變性的遺傳易感性為了模擬單基因脂質(zhì)代謝疾病導(dǎo)致的脂肪變性，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了APOB和MTTP基因敲除的類器官模型。這些基因在極低密度脂蛋白（VLDL）顆粒的組裝和分泌中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其突變會導(dǎo)致家族性低β脂蛋白血癥和abetalipoproteinemia等疾病。通過CRISPR技術(shù)敲除這些基因后，研究人員觀察到類器官在穩(wěn)態(tài)條件下自發(fā)積累了大量脂質(zhì)，達(dá)到約30%的脂肪變性水平（圖2d,e）。脂質(zhì)組學(xué)分析表明，這些類器官中甘油三酯（TAG）的積累主要來源于內(nèi)源性脂質(zhì)合成（DNL），而非外源性脂質(zhì)來源（圖2f,g）。圖2：通過引入APOB或MTTP突變產(chǎn)生的DNL產(chǎn)生的脂質(zhì)積累的類器官模型為了尋找能夠減輕脂肪變性的藥物，研究團(tuán)隊(duì)對17種候選NAFLD藥物進(jìn)行了篩選。這些藥物包括ACC抑制劑、FAS抑制劑、DGAT2抑制劑等，旨在抑制脂質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶。結(jié)果顯示，多種藥物在不同脂肪變性模型中均表現(xiàn)出顯著的抗脂肪變性效果，特別是ACC抑制劑和FAS抑制劑，它們能夠顯著減少類器官中的脂質(zhì)積累（圖3b,c,d）。此外，F(xiàn)XR激動劑和重組人FGF19也顯示出良好的治療效果，能夠減少約50%的脂肪變性水平（圖3c）。圖3：捕捉人肝脂肪變性不同類器官模型中的藥物反應(yīng)通過RNA-seq分析，研究人員進(jìn)一步揭示了不同藥物對類器官轉(zhuǎn)錄組的影響。ACC和FAS抑制劑不僅下調(diào)了與糖酵解和脂肪酸合成相關(guān)的基因表達(dá)，還抑制了與細(xì)胞周期和DNA合成相關(guān)的基因，提示這些藥物可能具有潛在的副作用，如抑制肝細(xì)胞增殖和再生能力（圖4b,c,d,e）。相比之下，F(xiàn)XR激動劑和FGF19主要通過誘導(dǎo)FGF19信號通路和抑制DNL來減少脂肪變性，同時(shí)伴隨著一定程度的上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）的誘導(dǎo)，這可能解釋了FGF19基因在肝癌中的擴(kuò)增現(xiàn)象（圖4d,e）。圖4：基于轉(zhuǎn)錄組的治療聚類揭示了減少脂肪變性的藥物作用和不良反應(yīng)為了加速基因編輯和靶點(diǎn)篩選過程，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一個基于CRISPR敲除的篩選平臺FatTracer。該平臺利用APOB?/?和MTTP?/?類器官作為“天然”脂肪變性模型，對35個與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因進(jìn)行了系統(tǒng)篩選。結(jié)果顯示，F(xiàn)ADS2基因在這一過程中脫穎而出，成為脂肪變性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（圖5c）。FADS2是Δ6去飽和酶，參與多不飽和脂肪酸（PUFA）的生物合成。FADS2敲除加劇了脂肪變性表型，而過表達(dá)FADS2則顯著減輕了脂肪變性（圖6a-h）。圖5：開發(fā)FatTracer作為CRISPR篩選平臺可識別脂肪變性介質(zhì)機(jī)制研究表明，F(xiàn)ADS2通過調(diào)節(jié)PUFA與DNL之間的平衡來影響脂肪變性水平。FADS2過表達(dá)增加了PUFA的豐度，進(jìn)而抑制了DNL途徑，減少了TAG的積累（圖6i-m）。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了FADS2在脂肪變性中的作用機(jī)制，還為開發(fā)針對NAFLD的新藥物提供了潛在靶點(diǎn)。圖6：FADS2是人肝細(xì)胞脂肪變性水平的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子綜上所述，本研究通過構(gòu)建人類胎兒肝細(xì)胞類器官模型并利用CRISPR基因編輯技術(shù)和FatTracer篩選平臺，成功揭示了脂肪變性的分子機(jī)制和潛在治療靶點(diǎn)。未來研究可以進(jìn)一步探索FatTracer平臺在NAFLD其他階段（如NASH）中的應(yīng)用，并通過引