AbMole 體內(nèi)免疫肽組揭示新的腫瘤特異性抗原

AbMole|解密體內(nèi)免疫肽組揭示新的腫瘤特異性抗原由AlexM.Jaeger,LaurenE.Stopfer,RyuhjinAhn等人在“Nature”上發(fā)表的名為“Decipheringtheimmunopeptidomeinvivorevealsnewtumourantigens”的文章，在該文章中，使用了AbMole的CHIR99021（M1692）、PD0325901（M1763）的2種產(chǎn)品。癌癥的免疫治療近年來取得了顯著進展，其核心在于通過激活機體自身的免疫系統(tǒng)來識別和攻擊腫瘤細胞。這一過程依賴于主要組織相容性復合體I類（MHC-I）分子在細胞表面呈遞的肽抗原，這些肽抗原通常由腫瘤細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)生。然而，當前對MHC-I相關(guān)肽（即免疫肽組）的研究主要依賴于體外實驗或腫瘤裂解物分析，這些方法往往忽略了體內(nèi)微環(huán)境對肽抗原呈遞的復雜影響。為了更深入地理解體內(nèi)腫瘤特異性抗原的呈遞機制，研究人員設(shè)計并驗證了一種新型小鼠模型，該模型能夠在體內(nèi)精確分離MHC-I肽，并揭示了多種新的腫瘤抗原。癌癥免疫監(jiān)視依賴于免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞表面MHC-I分子上呈遞的肽抗原的識別。然而，現(xiàn)有的MHC-I肽組研究方法多局限于體外細胞培養(yǎng)或腫瘤裂解物分析，這些方法難以全面反映體內(nèi)復雜的生理環(huán)境和腫瘤特異性。因此，研究人員設(shè)計了一種在小鼠MHC-I基因中插入誘導型親和標簽的方法，以實現(xiàn)在體內(nèi)精確分離和鑒定MHC-I肽，進而揭示腫瘤特異性抗原的呈遞機制。研究人員首先在小鼠MHC-I基因（H2-K1）內(nèi)含子1中插入了一個Cre可誘導的外顯子，該外顯子編碼高度特異性的親和標簽StrepTagII。這一設(shè)計使得在Cre重組酶的作用下，StrepTagII會被整合到成熟的H2-Kb蛋白的N端，從而允許通過StrepTactin親和樹脂特異性地純化帶有StrepTagII的MHC-I肽。隨后，這一KbStrep等位基因被靶向整合到攜帶KrasLSL-G12D/+Trp53fl/fl（KP）基因型的小鼠胚胎干細胞中，從而建立了可用于研究體內(nèi)腫瘤特異性抗原呈遞的新型小鼠模型。圖1KPKbStrep小鼠模型的設(shè)計與驗證為了研究胰腺癌（PDAC）和肺腺癌（LUAD）的免疫肽組，研究人員通過不同的途徑在KP小鼠中誘導了腫瘤。對于PDAC，通過胰腺導管內(nèi)逆行注射表達Cre重組酶的腺病毒，誘導了自發(fā)生成的胰腺癌。對于LUAD，則通過氣道內(nèi)給予表達Cre重組酶的腺病毒，在KP小鼠中誘導了肺腺癌。在腫瘤誘導成功后，研究人員采集了不同時間點的腫瘤樣本以及相應的正常組織樣本，用于后續(xù)的MHC-I肽分離和分析。圖2LUAD免疫肽球在整個腫瘤進化過程中是動態(tài)和異質(zhì)性的圖3LUAD特有肽的轉(zhuǎn)錄和翻譯為了精確分離MHC-I肽，研究人員采用了抗體免疫沉淀（Ab-IP）和StrepTactin親和純化兩種方法。抗體免疫沉淀方法使用特異性抗體結(jié)合MHC-I分子，從而分離出與之結(jié)合的肽段。而StrepTactin親和純化方法則利用StrepTagII與StrepTactin之間的高親和力，特異性地純化出帶有StrepTagII的MHC-I肽。分離得到的肽段隨后通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）進行分析，以確定其序列和特性。圖4LUAD中新腫瘤抗原的發(fā)現(xiàn)通過比較體外培養(yǎng)的細胞、原位移植的腫瘤以及自發(fā)生成的腫瘤中MHC-I肽的組成，研究人員發(fā)現(xiàn)體內(nèi)特異性分離的MHC-I肽覆蓋了更廣泛的免疫肽組。特別是，通過StrepTactin親和純化鑒定出的多種肽段僅在體內(nèi)腫瘤樣本中特異性出現(xiàn)，這表明體內(nèi)微環(huán)境對MHC-I肽的呈遞具有重要影響。為了進一步探究體內(nèi)MHC-I肽的細胞類型特異性，研究人員利用單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)分析了健康肺組織和腫瘤組織中基因表達譜的差異。結(jié)果表明，通過StrepTactin親和純化的MHC-I肽強烈反映了肺泡2型（AT2）細胞的特征，這表明這些肽段主要由AT2細胞呈遞。相比之下，抗體免疫沉淀得到的肽段則包含多種細胞類型的污染，進一步驗證了體內(nèi)特異性分離方法的優(yōu)越性。隨著LUAD的進展，研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫肽組逐漸偏離了正常AT2細胞的特征。通過基因集富集分析（GSEA），他們發(fā)現(xiàn)晚期腫瘤肽簽名與胃癌上皮模塊和高度混合轉(zhuǎn)錄模塊的相關(guān)性顯著增加，而與AT2模塊的相關(guān)性顯著減少。這表明腫瘤在進化過程中發(fā)生了顯著的免疫逃逸機制轉(zhuǎn)變，進而影響了MHC-I肽的呈遞模式。通過質(zhì)譜分析，研究人員在LUAD樣本中鑒定出了135種非突變腫瘤特異性抗原（TSA）和147種腫瘤相關(guān)抗原（TAA）。為了驗證這些抗原的免疫原性，他們選擇了其中部分抗原制備了疫苗，并通過骨髓衍生的樹突狀細胞（BMDC）接種給小鼠。結(jié)果表明，多種TSA和TAA在疫苗接種后成功誘導了顯著的CD8+T細胞反應。特別是PRDM15來源的肽SVAHFINL在腫瘤組織中特異性地誘導了強烈的T細胞反應，進一步證實了其在腫瘤免疫治療中的潛力。盡管mRNA表達水平和預測親和力在一定程度上可以指導MHC-I肽的篩選和驗證工作，但研究人員發(fā)現(xiàn)許多腫瘤特異性肽的呈現(xiàn)并不能完全通過這些因素來解釋。為了進一步探究抗原呈遞的分子機制，他們利用核糖體分析（Ribo-seq）技術(shù)研究了相關(guān)基因的翻譯效率變化。結(jié)果表明LUAD特異性肽的基因在腫瘤中表現(xiàn)出顯著的翻譯效率變化，這提示翻譯后修飾在抗原呈遞過程中發(fā)揮了重要作用。此外他們還發(fā)現(xiàn)LUAD特異性肽的來源蛋白在穩(wěn)定性和細胞定位方面也存在差異進一步支持了翻譯后修飾對抗原呈遞的影響。本研究通過體內(nèi)精確分離MHC-I肽的方法揭示了腫瘤免疫肽組的復雜性和動態(tài)變化性。研究結(jié)果表明體內(nèi)外MHC-I肽的組成存在顯著差異且受腫瘤微環(huán)境影響顯著；同時研究還發(fā)現(xiàn)了多種新的腫