DB3717T 23-2024 植物種苗組培技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20CCSB05

3717菏 澤 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB3717/T23—2024植物種苗組培技術(shù)規(guī)程Technicalcodeofplantmicropropagation2024-06-28發(fā)布 2024-07-28實施菏市市監(jiān)督理局 發(fā)布DB3717/T23DB3717/T23—2024PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1培養(yǎng)基的配制 1母液的配制 1植物接種培養(yǎng)基 1植物材料的選擇與外植體滅菌 2植物組培苗外植體母本圃種植 2植物材料選擇時間 2植物材料部位的確定和選擇 2儀器和植物外植體材料的滅菌 2儀器及培養(yǎng)基的最少消毒時間 2儀器和培養(yǎng)基與外植體消毒 2植物外植體的無菌操作 3組織培養(yǎng)苗試管培養(yǎng) 3愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng) 3增殖繼代培養(yǎng) 3植物組織生根培養(yǎng) 3組織苗煉苗移栽 3移栽穴盤苗的管理 3包裝與運(yùn)輸 3包裝 3運(yùn)輸 4附錄A（規(guī)范性） 培養(yǎng)基母液配制 5附錄B（規(guī)范性） 不同植物品種常用培養(yǎng)基配法 6附錄C（規(guī)范性） 生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制 7附錄D（規(guī)范性） 植物不同器官消毒順序 9附錄E（規(guī)范性） 器皿及培養(yǎng)基的最少滅菌時間 10附錄F（規(guī)范性） 儀器和培養(yǎng)基的消毒壓力和溫度與排氣的關(guān)系 11附錄G（規(guī)范性） 植物外植體材料的滅菌常用消毒劑效果 12附錄H（規(guī)范性） ABT生根粉種類及使用濃度 8附錄I（規(guī)范性） 不同植物激素種類與使用濃度 13前 言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由菏澤市林業(yè)局提出、歸口并組織實施。本文件起草單位：菏澤市林業(yè)科學(xué)研究院、菏澤市林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心、菏澤市自然資源和規(guī)劃局、菏澤市行政審批踏勘評審中心、菏澤林業(yè)技術(shù)服務(wù)中心、鄆城縣陽光花卉有限公司。﹑王金國﹑任升﹑李艷玲﹑﹑羅松﹑李新艷﹑劉金錦﹑王海燕﹑蘇麗娟﹑張淼﹑王傳印﹑左傳偵。DB3717/T23DB3717/T23—2024PAGEPAGE10植物種苗組培技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了植物種苗組培的術(shù)語和定義、培養(yǎng)基配制、接種操作流程、包裝和運(yùn)輸。本文件適用于菏澤市植物種苗的組培。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T1965-2003 日光溫室和塑料大棚結(jié)構(gòu)與性能要求術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。種苗germchit種子播種發(fā)芽后，一般生長到2對真葉，適合移植到其它環(huán)境生長的幼小植株。組培苗tissuecultureseedling利用植物器官、組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體，在無菌和適宜的人工條件下，培育植株。培養(yǎng)基的配制母液的配制MS培養(yǎng)基母液配制參見附錄A。不同植物品種常用培養(yǎng)基配制方法見附錄B。配制好的母液瓶上分別貼上標(biāo)簽，注明母液號﹑配制倍數(shù)﹑日期及配制1L培養(yǎng)基時應(yīng)取的量。定容后貯藏于冰箱中保存?zhèn)溆?。生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制見附錄C，定容后貯藏于冰箱中保存?zhèn)溆?，若貯藏時間過長，發(fā)生乳析現(xiàn)象應(yīng)震蕩均勻后使用。植物接種培養(yǎng)基配制先將貯藏的母液依次按順序擺放好,再準(zhǔn)備好各種玻璃器皿﹑量筒﹑燒杯﹑吸管﹑玻璃棒﹑漏斗等。稱好瓊脂﹑蔗糖，配好生長調(diào)節(jié)劑。準(zhǔn)備好蒸餾水和封瓶口用的繩子﹑封口紙。根據(jù)培養(yǎng)基的配方分別用吸管吸取培養(yǎng)基母液，把依母液的濃度量取規(guī)定量滴入量筒中。加完母液依培養(yǎng)基的配方計算出所需生長調(diào)節(jié)劑的量，吸取滴入量筒中，定容到1000ml所需的體積。把定容的培養(yǎng)基液倒入含有0.6%～1.0%瓊脂﹑1%～5%蔗糖的加熱容器內(nèi)繼續(xù)加熱，不斷攪拌，直至使瓊脂完全溶解。接種培養(yǎng)基的pH值控制在5.5～6.0，用0.1N～1N的HCL(NaOH)對培養(yǎng)基pH值進(jìn)行調(diào)整。分裝趁熱分裝培養(yǎng)基，一般占試管、三角瓶等容器1/3～1/4左右為宜。注意避免培養(yǎng)基粘到瓶壁上，防止感染雜菌。消毒分裝好的培養(yǎng)基、無菌水、接種工具放入高壓消毒鍋中(滅菌壓力0.11MPa～0.14MPa,120℃～126℃,15min～20min)，不要裝入太滿影響蒸汽循環(huán)。高壓滅菌后培養(yǎng)基取出，放置凝固后接種使用。植物材料的選擇與外植體滅菌植物組培苗外植體母本圃種植將性狀優(yōu)良的組培苗種植在溫室內(nèi),加強(qiáng)水肥管理,使植株生長健壯,減少植物體表面的細(xì)菌﹑真菌﹑微生物的數(shù)量。植物材料選擇時間3月植物外植體形成愈傷組織最多，7月次之，最次12月愈傷組織形成最少，確定最佳時間為3月份。植物材料部位的確定和選擇根據(jù)組織培育目的，可選擇根﹑莖﹑葉等組織和器官，一般選擇植物的莖段作為植物培育外植體。植物不同器官滅菌順序見附件D。儀器及培養(yǎng)基的最少消毒時間見附錄E。器皿和金屬器械滅菌采用高溫高壓蒸汽滅菌法，器皿、金屬器械和培養(yǎng)基的最少滅菌時間參見附錄。儀器﹑培養(yǎng)基與外植體消毒儀器﹑培養(yǎng)基的消毒壓力和溫度與排氣的關(guān)系見附錄F。植物外植體材料的滅菌常用消毒劑效果見附錄G。無菌室的滅菌接種前一天,高錳酸鉀與甲醛混合產(chǎn)生的霧化氣體封閉無菌室滅菌，并紫外燈照射30min。植物外植體的無菌操作植物組織的整個接種過程均需無菌操作。將滅菌沖洗干凈的嫩梢0.5cm～1cm小段放在超凈工作臺無菌的環(huán)境中,用左手鑷子夾住莖尖,右手用解剖刀除去幼芽的外面部分,切取頂端0.5mm～1mm大小的芽接種在滅菌的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織分化培養(yǎng)，可將病毒除去。組織培養(yǎng)苗試管培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)MS+6-BA0.5mg/L+2·4-D1mg/L+KT0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH值為6.0左右，培養(yǎng)室溫25±2℃，每天12h光照。（不同植物激素使用種類與濃度見附錄H）。增殖繼代培養(yǎng)愈傷組織脫分化培養(yǎng)后，切下形成的小芽，接種在MS+6-BA2mg/L+IAA0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH6.02～4周器官分化,形成纖弱小芽。6.2.2 芽長至1～2cm時切下轉(zhuǎn)到MS+6-BA（2mg/L）+KT（0.3mg/L）+IAA（0.5mg/L）+3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH值為6.0左右的培養(yǎng)基上,用于壯苗。隨著繼代增殖培養(yǎng)逐漸減少6-BA的用量，最后一次繼代增殖培養(yǎng)可以加少量的IAA﹑NAA﹑IBA便于外植體的復(fù)壯與生根。植物組織生根培養(yǎng)生長健壯、適于生根的叢生無根苗,接種在1/2MS(大量元素減半)+NAA0.2-0.5mg/L+IBA2.0mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂,PH值6.0左右的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～40天,基部切口處產(chǎn)生新根。組織苗煉苗移栽1～55cm～8cm23℃～25℃的溫室中接受自然光的照射，3～6將清洗干凈的試管苗在50%可濕性粉劑多菌靈30～70倍液與ABT生根劑液中浸泡（ABT生根粉種類與濃度見附錄I），定植在混合基質(zhì)中，混合基質(zhì)配方是泥炭：蛭石：珍珠巖（2：1：1）。注意覆蓋小拱棚及遮陰網(wǎng)，避強(qiáng)光且保濕；移栽前試管苗澆灌0.5g/L的多菌靈溶液進(jìn)行基質(zhì)消毒。移栽穴盤苗的管理15℃～28℃，相對濕度控制在80%～90%，光照強(qiáng)度控制在5000LX～10000LX～1500倍的多菌靈或百菌清等殺菌劑一次。包裝與運(yùn)輸包裝試管苗及穴盤苗包裝:將代有試管的組培苗裝在泡沫箱里,外面在用紙箱包裝；穴盤苗連同穴盤放在紙箱里，層層放置，保持立體空間。每箱貼上標(biāo)簽,注明品種﹑等級﹑規(guī)格﹑數(shù)量、產(chǎn)地等放在托盤上運(yùn)輸。運(yùn)輸及時冷藏運(yùn)輸,避免極端天氣。培養(yǎng)基母液配置見表A.1。

附 錄 A（規(guī)范性）表1.1培養(yǎng)基母液配置母液編號化合物名稱規(guī)定量擴(kuò)大倍數(shù)稱取量母液體積(ml)1L培養(yǎng)基吸取量(ml)母液1KNO?190010190001000100NH4NO?16501016500S4·2O370103700KH2PO4170101700al2·2O440104400nS4·2O22.31002230nS4·2O8.6100860H3BO36.2100620母液2nS4·2O22.31002230100010nS4·2O8.6100860H3BO36.2100620IK0.8310083aMoO4·2O0.2510025uS4·2O0.0251002.5CaCl26H2O0.0251002.5母液3a-EDA3730010005FeSO4?7H2O27800母液4甘氨酸2.05010050010維生素B10.45020維生素B60.55025煙酸0.55025肌醇100505000附 錄 B（規(guī)范性）不同植物品種常用培養(yǎng)基配法不同植物品種常用培養(yǎng)基配法見表B.1。表1.2不同植物品種常用培養(yǎng)基配法名稱愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基繼代增值培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基泡桐+6-B10L+T.mLS+-B2./+NA02L康乃馨S+-B05/+2·-DgLS+-B2./+NA05L1/2MS+IBA2.0mg/L+NAA0.5mg/L蘋果+6-B05L+T.mL+6-A05L+A3/L1/2MS+IBA2.0mg/L+NAA1.0mg/L滿天星+6-B05L+T.mL+6-A20L+T.gL1/2MS+NAA0.5mg/L獼猴桃+6-B30L+T.mLMS+IBA0.5mg/L+ZT2.0mg/L1/2MS+IBA2.0mg/L+0.4~0.5%活性炭水仙MS+ZT2.0+NAA0.5mg/L+IAA0.5mg/LMS+NAA2.0mg/L+IAA0.5mg/L1/2MS+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L人參+6-B01L+T.mL+6-A01L+BA.mL1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.5mg/L甜橙+6-A20L+AA.mL+6-A10L+BA.mL1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.4mg/L菠蘿+6-A20L+AA.mLS+-B0./+IA1LNAA.mL1/2MS+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L蝴蝶蘭1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.5mg/L+0.5%活性炭附 錄 C（規(guī)范性）生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制見表C.1。表1.3生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制名稱溶質(zhì)濃度(mg/ml)稱取量(單位:mg)母液體積(ml)IAA95%酒精少量0.110100NAA95%酒精少量0.110100IBA95%酒精少量0.110100KT1NHCL少量0.110100-BA1NHCL少量0.110100ZT95%酒精少量0.110100植物不同器官消毒順序見表D.1。

附 錄 D（規(guī)范性）植物不同器官消毒順序表1.4植物不同器官消毒順序器官消毒順序消毒前消毒消毒后備注種子純酒精浸泡15分鐘,用無菌水沖洗1%溴水浸泡5min。無菌水沖洗3次，放在無菌環(huán)境中發(fā)芽。用幼芽與幼根產(chǎn)生愈傷組織。果實純酒精迅速清洗2%的次氯酸鈉浸泡15min織和種子。獲得無菌組織。莖切段洗滌液清洗2%的次氯酸鈉浸泡15min無菌水清洗3~5次直接接種在培養(yǎng)基上或切取組織進(jìn)行培養(yǎng)貯藏器官自來水沖洗2%次氯酸鈉浸泡20~30min無菌水清洗3~5次取出消毒材料內(nèi)部組織進(jìn)行培養(yǎng)葉片用自來水清洗吸干用洗滌液清洗70%的酒精漂洗;2%次氯酸鈉浸泡20~30min無菌水沖洗3次,無菌濾紙吸干。嫩葉﹑葉片平放或扦插在培養(yǎng)基中。附 錄 E（規(guī)范性）儀器和培養(yǎng)基的最少滅菌時間儀器和培養(yǎng)基的最少滅菌時間見表E.1。表1.5儀器和培養(yǎng)基的最少滅菌時間容器的體積(ml)在121℃下最少滅菌時間(min)20~50157520250~50025100030150035200040附 錄 F（規(guī)范性）儀器﹑培養(yǎng)基的消毒壓力和溫度與排氣的關(guān)系儀器﹑培養(yǎng)基的壓力和溫度與排氣的關(guān)系見表F.1。表1.6儀器﹑培養(yǎng)基的壓力和溫度與排氣的關(guān)系排氣溫度(℃)壓力(磅)空氣的排除量完全排除2/3排除1/2排除1/3排除未排除51091009490721011510910510090151211151121091002012612111811510925130126124121115附 錄 G（規(guī)范性）植物外植體常用消毒劑效果植物外植體常用消毒劑效果見表G.1。表1.7植物外植體常用消毒劑效果消毒劑使用濃度(%)去除的難易消毒時間(min)效果次氯酸鈣9~10易5~30很好次氯酸鈉2易5~30很好過氧化氫10~12最易5~15好溴 水1~2易2~10很好硝酸銀1較難5~30好抗菌劑4~50中30~60很好附 錄 H（規(guī)范性）ABT生根粉種類及使用濃度ABT生根粉種類及使用濃度見表H.1。表1.8ABT生根粉種類及使用濃度類別使用濃度.-1)浸泡時間(h)用處ABT11003~8用于難生根及珍貴植物ABT250~1002~3用于較容易生根的植物ABT30-00