SNT 1961.10-2013 出口食品過敏原成分檢測 第10部分：實時熒光PCR方法檢測蝦蟹成分

出口食品過敏原成分檢測第10部分：實時熒光PCR方法檢測蝦/蟹成分I 第3部分：酶聯(lián)免疫吸附法檢測蕎麥蛋白成分：——第4部分：實時熒光PCR方法檢測腰果成分；——第6部分：實時熒光PCR方法檢測胡桃成分； 第11部分：實時熒光PCR方法檢測麩質(zhì)成分 本部分為SN/T1961的第10部分。民共和國遼寧出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國浙江出入境檢驗檢疫局、上海輝睿生物科技有限出口食品過敏原成分檢測第10部分：實時熒光PCR方法檢測蝦/蟹成分25.1.1.1蝦16SrRNA基因的第一對檢測引物和探針序列5.1.1.2蝦16SrRNA基因的5.1.1.3北極蝦16SrRNA基因的檢測引物和探針序列1%CTAB,0.05mol/LTris-HCl(pH8.0),0.7mol/LNaCl,0.01mol/LED35.3TE緩沖液(Tris-Cl、EDTA緩沖液)10mmol/LTri5.770%乙醇。5.8TaqDNA聚合酶。200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/LKCl,15mmol/LMgCl?。6儀器和設(shè)備6.1實時熒光PCR儀。6.2離心機：離心力≥12000g。6.4冰箱：2℃~8℃,-20℃。6.5高壓滅菌器。6.6研缽及粉碎裝置。6.7核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。6.9恒溫水浴箱。7檢驗步驟7.1制樣方法稱取約200g樣品，用研缽或粉碎裝置將樣品粉碎至粉末狀。7.2樣品的總DNA提取7.2.1稱取2.0g已制備好的樣品于50mL離心管中，加入10mL裂解液，65℃溫育1h,每隔10min振7.2.27000g離心5min,吸取上清液至一新離心管中，加入400μL三氯甲烷和異戊醇的混合液，體積比為24:1,充分混勻；7.2.312000g離心5min,吸取上清液至一新離心管中，加0.8倍體積異丙醇，室溫下沉淀1h~2h;7.2.412000g離心10min,棄上清液；7.2.570%乙醇洗滌一次，12000g離心5min,棄上清液，晾干；7.2.6加入50μLTE,溶解DNA沉淀。也可用等效的商品化核酸提取試劑盒提取模板DNA。7.3DNA濃度和純度的測定取適量DNA溶液原液加雙蒸水稀釋一定倍數(shù)后，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測260nm4c=A?60XN×50 A?60——260nm處的吸光值；當濃度為10μg/mL～100μg/mL,A?bo/A280比值在1.7～1.9之間時，適宜于實時熒光PCR擴增。7.4實時熒光PCR檢測7.4.1實時熒光PCR反應(yīng)體系過敏原蝦/蟹成分熒光PCR反應(yīng)體系見表1。表1過敏原蝦/蟹成分熒光PCR反應(yīng)體系下游引物DNA模板注：各組分的用量可根據(jù)反應(yīng)體積進行適當?shù)恼{(diào)7.4.2實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性95℃/30s,1個循環(huán)；95℃/15s,60℃/4gs,45個循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時收集熒光信號。反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因擴增儀型號以及所使用試劑的不同而進行適當?shù)恼{(diào)整。每個樣品設(shè)置兩個平行反應(yīng)體系。檢測過程中應(yīng)分別設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照。用已知含蝦/蟹成分的樣品作陽性對照，用已知不含蝦/蟹成分的樣品作陰性對照，用等體積的ddH?O代替模板DNA作空白對照。8結(jié)果判斷及表述8.1結(jié)果分析條件設(shè)定直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最高點，且Ct值不出現(xiàn)任何數(shù)值為準。5