6.8染菌的防治公開課一等獎?wù)n件省賽課獲獎?wù)n件

7.8染菌的防治發(fā)酵過程中除了生產(chǎn)菌以外，尚有其它菌生長繁殖什么是染菌？7.8.1染菌的影響造成大量原材料的浪費(fèi)，在經(jīng)濟(jì)上造成巨大損失擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計劃碰到持續(xù)染菌，特別在找不到染菌因素往往會影響人們的情緒和生產(chǎn)主動性影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量發(fā)酵過程污染雜菌，會嚴(yán)重的影響生產(chǎn)，是發(fā)酵工業(yè)的致命傷（一）染菌對發(fā)酵的影響不同污染時間，不同污染途徑，污染不同菌量，不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件又可產(chǎn)生不同后果生產(chǎn)不同的品種，可污染不同種類和性質(zhì)的微生物1、發(fā)酵染菌對不同品種的影響放線菌由于生長的最適pH為7左右，因此染細(xì)菌為多，而霉菌生長pH為5左右，因此染酵母菌為多不同菌不同產(chǎn)品青霉素發(fā)酵染菌，絕大多數(shù)雜菌都能直接產(chǎn)生青霉素酶，而另某些雜菌則可被青霉素誘導(dǎo)而產(chǎn)生青霉素酶。不管在發(fā)酵前期、中期或后期，染有能產(chǎn)生青霉素酶的雜菌，都能使青霉素快速破壞鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素等雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一無所得，但也會造成不同程度的危害。如雜菌大量消耗營養(yǎng)干擾生產(chǎn)菌的正常代謝；變化pH，減少產(chǎn)量灰黃霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素克制霉菌，對細(xì)菌幾乎沒有克制和殺滅作用不同產(chǎn)品疫苗生產(chǎn)染菌危害很大?，F(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不管死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。因此，發(fā)酵罐容積越大，污染雜菌后的損失也越大不同產(chǎn)品2、污染不同種類和性質(zhì)的微生物的影響噬菌體的感染力很強(qiáng)，傳輸蔓延快速，也較難防治，故危害極大污染噬菌體后，可使發(fā)酵產(chǎn)量大幅度下降，嚴(yán)重的造成斷種，被迫停產(chǎn)（1）污染噬菌體有些雜菌會使生產(chǎn)菌自溶產(chǎn)生大量泡沫，即使添加消泡劑也無法控制逃液，影響發(fā)酵過程的通氣攪拌有的雜菌會使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，致使pH下降，使不耐酸的產(chǎn)品破壞特別是染芽孢桿菌，由于芽孢耐熱，不易殺死，往往一次染菌后會重復(fù)染菌（2）污染其它雜菌3、不同時間染菌對發(fā)酵的影響雜菌進(jìn)入培養(yǎng)液后，需有足夠的生長、繁殖的時間才干顯現(xiàn)出來，顯現(xiàn)的時間又與污染菌量有關(guān)。污染的菌量多，顯現(xiàn)染菌所需的時間就短，污染菌量少，顯現(xiàn)染菌的時間就長污染時間是指用無菌檢測辦法擬定的污染時間，不是雜菌進(jìn)入培養(yǎng)液的時間（1）種子培養(yǎng)期染菌由于接種量較小，生產(chǎn)菌生長一開始不占優(yōu)勢，并且培養(yǎng)液中幾乎沒有抗生素（產(chǎn)物）或只有極少抗生素（產(chǎn)物）。因而它防御雜菌能力低，容易污染雜菌。如果種子階段染菌，應(yīng)將培養(yǎng)液全部廢棄（2）發(fā)酵前期染菌染菌防治方法能夠用減少培養(yǎng)溫度，調(diào)節(jié)補(bǔ)料量，用酸堿調(diào)pH值，縮短培養(yǎng)周期等方法予以補(bǔ)救如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，能夠重新滅菌，補(bǔ)加某些營養(yǎng)，重新接種再用發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大因素發(fā)酵前期菌量不諸多，與雜菌沒有競爭優(yōu)勢；且尚未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生極少，抵抗雜菌能力弱。（3）發(fā)酵中期染菌

雜菌大量產(chǎn)酸，培養(yǎng)液pH下降糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶產(chǎn)物分泌減少或停止，甚至?xí)挂旬a(chǎn)生的產(chǎn)物分解有時也會使發(fā)酵液發(fā)臭，產(chǎn)生大量泡沫發(fā)酵中期染菌會嚴(yán)重干擾產(chǎn)生菌的代謝方法降溫培養(yǎng)，減少補(bǔ)料，親密注意代謝變化狀況如果發(fā)酵單位達(dá)成一定水平能夠提前放罐，或者抗生素生產(chǎn)中能夠?qū)⒏邌挝坏陌l(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，克制雜菌（4）發(fā)酵后期染菌發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對雜菌有一定的克制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對生產(chǎn)影響不大如果染菌嚴(yán)重，又破壞性較大，能夠提前放罐（二）發(fā)酵染菌對提煉和產(chǎn)品質(zhì)量的影響1、發(fā)酵染菌對過濾的影響染菌的發(fā)酵液普通發(fā)粘，菌體大多數(shù)自溶，因此在發(fā)酵液過濾時不能或很難形成濾餅，造成過濾困難即使采用加熱、冷卻、添加助濾劑等方法，使部分蛋白質(zhì)凝聚，但效果并不抱負(fù)如污染霉菌時，影響較小，而污染細(xì)菌時很難過濾由于過濾困難，過濾時間拉長，影響發(fā)酵液儲罐和過濾設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用，破壞了生產(chǎn)平衡染菌發(fā)酵液還會因過濾困難而大幅度減少過濾收率，直接影響提煉總收率污染雜菌的種類對過濾的影響程度有差別2、發(fā)酵染菌對提煉的影響采用離子交換樹脂提取工藝的產(chǎn)品，如鏈霉素、慶大霉素，由于染菌后大量雜菌黏附在離子交換樹脂表面，或被離子交換樹脂吸附，大大減少離子交換樹脂的交換容量，并且有的雜菌很難用水沖洗干凈，洗脫時與產(chǎn)物一起進(jìn)入洗脫液，影響進(jìn)一步提純?nèi)揪l(fā)酵液中含有比正常發(fā)酵液更多的水溶性蛋白和其它雜質(zhì)采用有機(jī)溶劑萃取的提煉工藝，則極易發(fā)生乳化，很難使水相和溶劑相分離，影響進(jìn)一步提純7.8.2染菌的因素總?cè)揪手敢荒臧l(fā)酵染菌的批（次）數(shù)與總投料批（次）數(shù)之比的百分率。染菌批次數(shù)應(yīng)涉及染菌后培養(yǎng)基經(jīng)重新滅菌，又再次染菌的批次數(shù)在內(nèi)。這是習(xí)慣的計算辦法，也是我國的統(tǒng)一計算辦法（一）發(fā)酵染菌率計算基準(zhǔn)例如，滅菌的蒸汽壓局限性不能滅菌；設(shè)備有滲漏不能進(jìn)罐等等都是眾所周知的，但由于有僥幸心理還是照樣滅菌，進(jìn)罐，成果以污染雜菌而告終（二）染菌因素造成染菌的因素諸多，經(jīng)驗表明，對絕大部分罐批染菌的因素是比較清晰的，但在實際生產(chǎn)中發(fā)酵染菌率仍比較高，能夠說產(chǎn)生這種現(xiàn)象大多數(shù)是由于工作中“明知故犯”“不負(fù)責(zé)任”和“僥幸心理”所造成的項目百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌9.64接種時罐壓跌零0.19培養(yǎng)基滅菌不透0.79總空氣系統(tǒng)有菌19.96泡沫冒頂0.48夾套穿孔12.36盤管穿孔5.89接種管穿孔0.39閥門滲漏1.45攪拌軸密封滲漏2.09罐蓋漏1.54其它設(shè)備滲漏10.13操作因素10.15因素不明24.94日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所數(shù)年來抗生素發(fā)酵染菌因素分析上海第三制藥廠染菌因素分析項目百分率%種子帶菌14.15盤管穿孔14.20閥門滲漏23.30空氣系統(tǒng)有菌10.0管理不善25.80其它7.49因素不明5.78

管理不善而染菌的有31個罐批，占25.80％經(jīng)分析有下表所列因素：

項目百分率%進(jìn)罐前未做設(shè)備嚴(yán)密度檢查25.8接種違反操作規(guī)程25.8檢修質(zhì)量缺少驗收制度19.35操作不純熟19.35配料違反工藝規(guī)程6.45調(diào)度不當(dāng)3.25第四制藥廠鏈霉素發(fā)酵染菌因素分析項目百分率%外界帶入雜菌（取樣、補(bǔ)料）8.20設(shè)備穿孔7.60空氣系統(tǒng)有菌26.00停電罐壓跌零1.60接種11.00蒸汽壓力局限性或蒸汽量局限性0.60管理問題7.80操作違反規(guī)程1.60種子帶菌0.60因素不明35.00造成染菌的重要因素總結(jié)1、設(shè)備滲漏

設(shè)備滲漏涉及夾套穿孔、盤管穿孔、接種管穿孔、閥門滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設(shè)備漏等從日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所對染菌因素分析發(fā)現(xiàn)，這類染菌占33.85％上海三廠的分析這類染菌為37.5％因此,加強(qiáng)設(shè)備本身及附屬零部件的嚴(yán)密度檢查，對制服染菌是極其重要的，也是重要的2、空氣帶菌從日本工業(yè)技術(shù)院和上海第四制藥廠分析空氣帶菌而造成的染菌分別為19.96％和26%國內(nèi)外空氣除菌技術(shù)雖已有較大改善，但仍然沒有使染菌率減少到抱負(fù)的程度由于空氣除菌系統(tǒng)較為復(fù)雜，環(huán)節(jié)多，偶遇不慎便會造成空氣除菌失敗3、種子帶菌種子帶菌又分為種子本身帶菌和種子培養(yǎng)過程中染菌加強(qiáng)種子管理，嚴(yán)格無菌操作，種子本身帶菌是能夠克服的種子培養(yǎng)過程染菌與發(fā)酵同樣有許多因素造成4、滅菌不徹底滅菌技術(shù)的好壞與滅菌質(zhì)量很有關(guān)系蒸汽通入培養(yǎng)基，升溫快慢、保溫時間——產(chǎn)生過多泡沫蒸汽總壓與否達(dá)成規(guī)定原則環(huán)境中的雜菌數(shù)量因季節(jié)而有很大差別。如上海第四制藥廠在卡那霉素生產(chǎn)中，于炎熱的夏季將持續(xù)滅菌預(yù)熱至800C的培養(yǎng)基采樣培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)無法計數(shù)的大量的芽孢桿菌；而在冬季取樣的培養(yǎng)中，則僅發(fā)現(xiàn)2～3個芽孢桿菌。故染菌率因季節(jié)不同而發(fā)生明顯變化。原材料儲存和保管，如液胨、玉米漿、母液糖等有機(jī)原料——雜菌的數(shù)量發(fā)酵罐、培養(yǎng)基配制罐等設(shè)備的清洗質(zhì)量——有無滅菌的死角對減少或避免染菌仍然是十分必要的5、技術(shù)管理不善技術(shù)管理就是要對發(fā)酵每個環(huán)節(jié)嚴(yán)格控制，發(fā)酵中稍有不慎就可能染菌，因此不能有僥幸心理而放松管理7.8.3無菌狀況的檢測1、環(huán)境無菌的檢查塵埃粒子檢測無菌平板檢測2、種子及發(fā)酵液無菌狀況檢測酚紅肉湯培養(yǎng)基檢測平板劃線顯微鏡觀察7.8.4染菌狀況分析染菌的因素有多個，對于實際狀況如何分析呢？1、單罐染菌不是系統(tǒng)問題，而是該罐本身的問題。如種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、罐有滲漏、分過濾器失效2、多罐染菌系統(tǒng)問題，如空氣過濾系統(tǒng)有問題，特別是總過濾器長久沒有檢查，可能受潮失效；移種或補(bǔ)料的分派站有滲漏或滅菌不徹底3、前期染菌種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底4、中后期染菌補(bǔ)料的料液滅菌不徹底或補(bǔ)料管道、閥門滲漏，普通不會是種子問題7.8.5染菌的避免1、避免種子帶菌制備種子時對沙土管及搖瓶嚴(yán)格加以控制。沙土制備時要多次間歇滅菌注意接種時的無菌操作子瓶、母瓶的移種和培養(yǎng)無菌室和搖床間都要保持清潔。無菌室內(nèi)要供應(yīng)恒溫恒濕的無菌空氣，還要裝紫外燈用以滅菌，或用化學(xué)藥品滅菌。無菌室規(guī)定在無菌室中裝有紫外燈，打開紫外燈，照半小時，關(guān)燈后15分鐘再接種用消毒藥水如新潔而滅配成1/1000濃度擦桌子、拖地，啟動超凈臺的通風(fēng)，接種時必須在超凈臺上操作，超凈臺裝有一臺鼓風(fēng)機(jī)，進(jìn)風(fēng)口有一粗過濾器，出風(fēng)口有高效過濾器，確保無菌風(fēng)從超凈臺吹出，外界有菌空氣不可能進(jìn)入接種區(qū)域，確保無菌條件。接種人員必須穿好無菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干凈2、避免設(shè)備滲漏發(fā)酵設(shè)備及附件由于化學(xué)腐蝕、電化學(xué)腐蝕，物料與設(shè)備摩擦造成機(jī)械磨損以及加工制作不良等因素會造成設(shè)備及附件滲漏。設(shè)備上一旦滲漏，就會造成染菌，例如冷卻盤管、夾套穿孔滲漏，有菌的冷卻水便會通過漏孔而進(jìn)入發(fā)酵罐中招致染菌。閥門滲漏也會使帶菌的空氣或水進(jìn)入發(fā)酵罐而造成染菌。設(shè)備上的漏隙如果肉眼能看見，容易發(fā)現(xiàn)，也容易治理；但有的微小泄漏，肉眼看不見，必須通過一定的試漏辦法才干發(fā)現(xiàn)。試漏辦法可采用水壓試漏法。即被測設(shè)備的出口處裝上壓力表，將水壓入設(shè)備，待設(shè)備中壓力上升到規(guī)定壓力，關(guān)閉進(jìn)出水，看壓力有否下降。壓力下降則有滲漏。但有些滲漏很小，看不出何處漏水，能夠用稀堿溶液壓入設(shè)備，然后用蘸有酚酞的紗布揩，只要酚酞能變紅處即為滲漏處。閥門滲漏能夠用集氣桶來試漏。辦法是先在集氣桶中裝滿水，然后關(guān)閉全部閥門，向發(fā)酵罐中通入空氣，使罐壓上升到規(guī)定壓力，普通1Kg以上。由于集氣桶連通各管道，觀察哪根管子冒泡，即這根管子的閥門漏氣。3、避免培養(yǎng)基滅菌不徹底培養(yǎng)基滅菌辦法——高壓蒸汽滅菌分批滅菌1210C，30分鐘持續(xù)滅菌罐溫125－1300C，30－45分鐘蒸汽下進(jìn)上出持續(xù)滅菌設(shè)備流程培養(yǎng)基滅菌前含有大量雜菌，滅菌時如果蒸汽壓力局限性，就達(dá)不到規(guī)定的溫度；滅菌時產(chǎn)生大量泡沫或發(fā)酵罐中有污垢堆積，就會窩藏大量雜菌，造成滅菌不徹底為什么蒸汽滅菌時會產(chǎn)生大量泡沫呢？培養(yǎng)基和水的傳熱系數(shù)比空氣的傳熱系數(shù)大，如果滅菌時升溫太快，培養(yǎng)基急劇膨脹，發(fā)酵罐內(nèi)的空氣排出較慢，就會產(chǎn)生大量泡沫，泡沫上升到發(fā)酵罐頂，泡沫中的耐熱菌就不能與蒸汽直接接觸，未被殺死解決辦法：緩慢啟動蒸汽閥門，或加入少量消泡劑滅菌時還會因設(shè)備安裝或污垢堆積造成某些“死角”。這些死角蒸汽不能有效達(dá)成，常會窩藏耐熱芽孢桿菌，因此設(shè)備安裝要注意不能造成死角發(fā)酵設(shè)備要經(jīng)常清洗，鏟除污垢4、避免空氣引發(fā)的染菌空氣過濾除菌設(shè)備流程空壓機(jī)儲罐二級冷卻加熱器空氣過濾粗過濾空氣冷卻器的列管穿孔泄露，冷卻水會滲入到空氣中，造成染菌棉花-活性炭過濾器長久使用后，棉花和活性炭的體積被壓縮而松動，如果上下端棉花鋪得厚薄不均，厚的一邊阻力大空氣不暢通，薄的一邊空氣容易通過，久而久之，薄的一邊長久受空氣頂吹而使棉花活性炭變化位置，造成過濾器失效。過濾器用蒸汽滅菌時，若被蒸汽冷凝水潤濕就會減少或喪失過濾效能，滅菌完畢應(yīng)立刻緩慢通入壓縮空氣，將水分吹干超細(xì)纖維紙作過濾介質(zhì)，滅菌時必須將管道中冷凝水放干凈，以免介質(zhì)受潮失效在生產(chǎn)實踐中，空氣管道大多與其它物料管道相接，要裝上止逆閥避免其它物料竄入空氣管道污染過濾器，造成過濾介質(zhì)失效5、發(fā)酵染菌后的方法染菌后的培養(yǎng)基必須滅菌后才可放下水道。滅菌辦法：可通蒸汽滅菌，也可加入過氧乙酸等化學(xué)滅菌劑攪拌30min，才放下水道。否則由于各罐的管道相通，會造成其它罐的染菌，并且直接放下水道也會造成空氣的污染而造成其它罐批染菌凡染菌的罐要找染菌的因素，對癥下藥，該罐也要徹底清洗，進(jìn)行空罐消毒，才可進(jìn)罐染菌厲害時，車間環(huán)境要用石灰消毒，空氣用甲醛熏蒸。特別，若染噬菌體，空氣必須用甲醛蒸汽消毒7.8.6染噬菌體的防治（一）染噬菌體對發(fā)酵的影響發(fā)酵過程中如果受噬菌體的侵染，普通發(fā)生溶菌，隨之出現(xiàn)發(fā)酵緩慢或停止，并且受噬菌體感染后，往往會重復(fù)持續(xù)感染，使生產(chǎn)無法進(jìn)行，甚至使種子全部喪失染噬菌體體現(xiàn)為：1、鏡檢可發(fā)現(xiàn)菌體數(shù)量明顯減少，菌體不規(guī)則，嚴(yán)重時完全看不到菌體，且是在短時間內(nèi)菌體自溶2、發(fā)酵pH值逐步上升，4~8小時之內(nèi)可達(dá)8.0以上，不再下降3、發(fā)酵液殘?zhí)歉?，有刺激臭味?/p>