飼料中玉米赤霉烯酮的測(cè)定 征求意見稿

1飼料中玉米赤霉烯酮的測(cè)定本文件描述了飼料中玉米赤霉烯酮的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和高效液相色譜法。本文件適用于植物性飼料原料、配合飼料、精料補(bǔ)充料和濃縮飼料中玉米赤霉烯酮的測(cè)定。本文件的檢出限為2μg/kg、定量限為10μg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（仲裁法）4.1原理試樣中的待測(cè)物用乙腈水溶液提取，提取液用磷酸鹽緩沖溶液稀釋，經(jīng)免疫親和柱凈化，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)，外標(biāo)法定量。4.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.2.1水：GB/T6682，一級(jí)。4.2.2甲醇：色譜純。4.2.3乙腈：色譜純。4.2.4甲酸：色譜純。4.2.5氯化鈉。4.2.6氫氧化鈉溶液（0.2mol/L稱取8.0g氫氧化鈉，用水溶解，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，定容，混勻。4.2.780%乙腈溶液：量取800mL乙腈（4.2.3）于1000mL容量瓶中，用水稀釋、定容，混勻。24.2.80.1%甲酸溶液：移取1mL甲酸（4.2.4）于1000mL容量瓶中，用水稀釋、定容，混勻。4.2.9磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：稱取8.0g氯化鈉、1.16g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀，用水溶解稀釋定容至1000mL，用氫氧化鈉溶液（4.2.6）調(diào)節(jié)pH至7.4。4.2.10乙腈-0.1%甲酸溶液：量取100mL乙腈（4.2.3）于1000mL容量瓶中，用0.1%甲酸溶液（4.2.8）稀釋、定容，混勻。4.2.11標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100μg/mL稱取玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)：17924-92-4，純度不低于99.5%）10mg（精確至0.01mg）于100mL容量瓶中，用乙腈（4.2.3）溶解、定容，混勻。－18℃以下貯存，有效期12個(gè)月。4.2.12標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（10μg/mL）：準(zhǔn)確移取5mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（4.2.11）于50mL容量瓶中，用乙腈（4.2.3）稀釋、定容，混勻。－18℃以下貯存，有效期6個(gè)月。4.2.13標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確移取適量的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（4.2.12）于10mL容量瓶中，用乙腈-0.1%甲酸溶液（4.2.10）配制成質(zhì)量濃度分別為2ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。臨用現(xiàn)配。4.2.14玉米赤霉烯酮免疫親和柱：柱容量≥1.5μg，柱回收率≥80%（驗(yàn)證方法參見附錄A），或性能相當(dāng)者。4.2.15微孔濾膜：0.22μm，有機(jī)系。4.3儀器設(shè)備4.3.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。4.3.2電子天平：精度0.01g、0.00001g。4.3.3渦旋混合器。4.3.4超聲波清洗器：功率≥250W。4.3.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥10000r/min。4.3.6氮吹儀：溫控范圍30℃~60℃。4.3.7固相萃取裝置。4.3.8空氣壓力泵。4.4樣品按GB/T20195規(guī)定制備試樣，至少200g，粉碎使其全部通過0.425mm孔徑的試驗(yàn)篩，混合均勻，裝入密閉容器中，備用。選取類型相同、均勻一致、且在待測(cè)物保留時(shí)間處，儀器響應(yīng)值小于方法定量限30%的飼料樣品，作為空白樣品。4.5試驗(yàn)步驟4.5.1提取平行做兩份試驗(yàn)。稱取試樣約5.0g（精確至0.01g），置于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入0.5g氯化鈉（4.2.5）和25mL80%乙腈溶液（4.2.7），渦旋混合2min，在250W的超聲功率下提取30min（每5min渦旋混合1次10000r/min離心5min，移取5mL上清液于50mL離心管中，加入20mLPBS（4.2.9），超聲混勻，備用。4.5.2凈化3將免疫親和柱連接至固相萃取裝置，將空氣壓力泵（4.3.8）與固相萃取裝置連接。準(zhǔn)確移取5mL樣品提取液（4.5.1），調(diào)節(jié)壓力使溶液以不大于2mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，抽干。分別以10mL純水淋洗柱子兩次（對(duì)顏色較重的樣品，第一次改用10mL10%甲醇水溶液清洗柱子一次），保持流速不大于2mL/min~3mL/min，并抽干。準(zhǔn)確加入1.5mL甲醇（4.2.2）洗脫，流速不大于2mL/min，上機(jī)測(cè)定。4.5.3基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制取基質(zhì)空白樣品，按4.5.1和4.5.2進(jìn)行提取和凈化處理，得到基質(zhì)空白溶液。分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（4.2.13）各1mL，于40℃下氮?dú)獯抵两?，?zhǔn)確加入1mL基質(zhì)空白溶液，渦旋混勻。配制成質(zhì)量濃度分別為2ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。臨用現(xiàn)配。4.5.4測(cè)定4.5.4.1液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a）色譜柱：C18柱，柱長(zhǎng)150mm，內(nèi)徑2.1mm，粒徑1.8μm，或性能相當(dāng)者；b）柱溫：40℃;c）流速：0.4mL/min；d）進(jìn)樣量：3μL；e）流動(dòng)相：A相為乙腈（4.2.3），B相為0.1%甲酸溶液（4.2.8），梯度洗脫程序見表1。表1梯度洗脫程序04584.5.4.2質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件如下：a）電離模式：電噴霧電離，負(fù)離子模式（ESI-）；b）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；c）毛細(xì)管電壓：3kV；e）霧化器溫度：500℃;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）離子對(duì)及碰撞能量參考值見表2。表2玉米赤霉烯酮特征離子及參考質(zhì)譜條件m/zm/zV44.5.4.3基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測(cè)定在儀器的最佳條件下，分別取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（4.5.3）和試樣溶液（4.5.2）上機(jī)測(cè)定。基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量離子色譜圖見附錄圖B.1。4.5.4.4定性在相同試驗(yàn)條件下，試樣溶液中待測(cè)物的保留時(shí)間應(yīng)與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（濃度相當(dāng)）中待測(cè)物的保留時(shí)間一致，其相對(duì)偏差在±2.5%之內(nèi)。根據(jù)表2選擇的定性離子對(duì)，比較試樣譜圖中待測(cè)物監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)離子豐度與質(zhì)量濃度接近的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中對(duì)應(yīng)的監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)離子豐度，若偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。表3定性測(cè)定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差±20±304.5.4.5定量以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子色譜峰的面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。試樣溶液中待測(cè)物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)，若超出線性范圍，應(yīng)重新測(cè)定。單點(diǎn)校準(zhǔn)定量時(shí)，試樣溶液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度相差不超過30%。4.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中玉米赤霉烯酮的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)wi計(jì)，數(shù)值以微克每千克(μg/kg）表示，多點(diǎn)校準(zhǔn)按式（1）計(jì)算，單點(diǎn)校準(zhǔn)按式（2）計(jì)算：wi=×f……（1）式中：ρ——由基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線查得試樣溶液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度，單位納克每毫升（ng/mLV1——試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mL）；V3——氮?dú)獯蹈珊蠹尤霃?fù)溶液的體積，單位為毫升（mL）f——試樣稀釋倍數(shù)；1000——換算系數(shù)；V2——凈化時(shí)所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mLm——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。wi=×f………………（2）5式中：A——試樣溶液中待測(cè)物的色譜峰面積；ρs——基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/mLV1——試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mL）；V3——氮?dú)獯蹈珊蠹尤霃?fù)溶液的體積，單位為毫升（mL1000——換算系數(shù)；f——試樣稀釋倍數(shù)；As——基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物的色譜峰面積；V2——凈化時(shí)所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mLm——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。測(cè)定結(jié)果以平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。4.7精密度在重復(fù)性條件下，兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對(duì)差值不大于該算術(shù)平均值的20%。5高效液相色譜法5.1原理試樣中的待測(cè)物經(jīng)乙腈水溶液提取后，提取液用磷酸鹽緩沖溶液稀釋，用免疫親和柱進(jìn)行凈化，高效液相色譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。5.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.2.1水：GB/T6682，一級(jí)。5.2.2乙腈：色譜純。5.2.3甲醇：色譜純。5.2.4氯化鈉。5.2.5氫氧化鈉溶液（0.2mol/L稱取8.0g氫氧化鈉，用水溶解，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，定容，混勻。5.2.680%乙腈溶液：移取800mL乙腈（5.2.2）于1000mL容量瓶中，用水稀釋、定容，混勻。5.2.7磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：稱取8.0g氯化鈉、1.16g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀，用水溶解稀釋定容至1000mL，用氫氧化鈉溶液（5.2.5）調(diào)節(jié)pH至7.4。5.2.8流動(dòng)相：量取460mL乙腈（5.2.2）至1000mL容量瓶中，混勻，備用。5.2.9標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（50μg/mL稱取玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)：17924-92-4，純度不低于99.5%）5mg（精確至0.01mg）于100mL容量瓶中，用乙腈（5.2.2）溶解、定容，混勻。－18℃以下貯存，有效期12個(gè)月。5.2.10標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（5μg/mL）：準(zhǔn)確移取10mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（5.2.9）于100mL容量瓶中，用乙腈（5.2.2）稀釋、定容，混勻。－18℃以下貯存，有效期6個(gè)月。65.2.11標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（5.2.10），用流動(dòng)相（5.2.8）稀釋成質(zhì)量濃度分別為20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。臨用現(xiàn)配。5.2.12玉米赤霉烯酮免疫親和柱：柱容量≥1.5μg，柱回收率≥80%（驗(yàn)證方法參見附錄A），或性能相當(dāng)者。5.2.13玻璃微纖維濾紙：無熒光特性。5.2.14微孔濾膜：0.22μm，有機(jī)系。5.3儀器設(shè)備5.3.1高效液相色譜儀：配有熒光檢測(cè)器。5.3.2電子天平：精度0.01g、0.00001g。5.3.3振蕩器：振蕩頻率≥50r/min。5.3.4氮吹儀：溫控范圍30℃~60℃。5.3.5高速均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速≥18000r/min。5.3.6固相萃取裝置。5.3.7空氣壓力泵。5.4樣品5.5試驗(yàn)步驟5.5.1提取平行做兩份試驗(yàn)。稱取試樣40g（精確至0.0及100mL80%乙腈溶液（5.2.6于振蕩器（5.3.3）上振蕩60min，或于高速均質(zhì)器（5.3.5）均質(zhì)2min后，用定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取10mL濾液并加入40mLPBS（5.2.7）稀釋，用玻璃纖維濾紙（5.2.13）過濾1次~2次，至濾液澄清，備用。5.5.2凈化將免疫親和柱連接至固相萃取裝置，將空氣壓力泵（5.3.7）與固相萃取裝置連接。準(zhǔn)確移取10mL樣品提取液（5.5.1），調(diào)節(jié)壓力使溶液以不大于2mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，抽干。分別以10mL純水淋洗柱子兩次（對(duì)顏色較重的樣品，第一次改用10mL10%甲醇水溶液清洗柱子一次），保持流速不大于2mL/min~3mL/min，并抽干。準(zhǔn)確加入1.5mL甲醇（5.2.3）洗脫，流速不大于2mL/min，收集洗脫液于40℃氮?dú)獯蹈?，?mL流動(dòng)相（5.2.8）溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，過濾膜（5.2.14），上機(jī)測(cè)定。5.5.3測(cè)定5.5.3.1高效液相色譜參考條件高效液相色譜參考條件如下：a）色譜柱：C18柱，柱長(zhǎng)150mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm，或性能相當(dāng)者；b）流動(dòng)相：甲醇（5.2.3）+水+乙腈（5.2.2）=46+8+46；c）流速：0.8mL/min；7d）檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)274nm，發(fā)射波長(zhǎng)440nm；e）進(jìn)樣量：20μL；f）柱溫：30℃。5.5.3.2標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測(cè)定在儀器的最佳條件下，分別取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（5.2.11）和試樣溶液（5.5.2）上機(jī)測(cè)定。玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖見附錄圖C.1。5.5.3.3定性以保留時(shí)間定性，試樣溶液中玉米赤霉烯酮的保留時(shí)間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（濃度相當(dāng)）中玉米赤霉烯酮的保留時(shí)間一致，其相對(duì)偏差在±2.5％之內(nèi)。5.5.3.4定量以玉米赤霉烯酮的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（響應(yīng)值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。試樣溶液中玉米赤霉烯酮的質(zhì)量濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。如超出范圍，應(yīng)將試樣溶液稀釋后重新測(cè)定。單點(diǎn)校準(zhǔn)定量時(shí)，試樣溶液中玉米赤霉烯酮的質(zhì)量濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度相差不超過30%。5.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中玉米赤霉烯酮的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)wi計(jì)，數(shù)值以微克每千克(μg/kg）表示，多點(diǎn)校準(zhǔn)按式（3）計(jì)算，單點(diǎn)校準(zhǔn)按式（4）計(jì)算：wi=×f……（3）式中：ρ——由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得試樣溶液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度，單位納克每毫升（ng/mLV1——試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mL）；V3——氮?dú)獯蹈珊蠹尤霃?fù)溶液的體積，單位為毫升（mL）；1000——換算系數(shù)；f——試樣稀釋倍數(shù)；V2——凈化時(shí)所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mLm——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。wi=×f……（4）式中：A——試樣溶液中待測(cè)物的色譜峰面積；ρs——標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/mLV1——試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mL）；V3——氮?dú)獯蹈珊蠹尤霃?fù)溶液的體積，單位為毫升（mL）；1000——換算系數(shù)；f——試樣稀釋倍數(shù)；As——標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物的色譜峰面積；8V2——凈化時(shí)所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mLm——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。測(cè)定結(jié)果以平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。5.7精密度在重復(fù)性條件下，獲得的玉米赤霉烯酮的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不大于其算術(shù)平均值的20%。9玉米赤霉烯酮免疫親和柱質(zhì)量驗(yàn)證方法A.1柱容量驗(yàn)證A.1.1在5mL的80%乙腈溶液-PBS（1:4，v:v）中加入9000ng玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，充分混勻。分別取同一批次3根免疫親和柱，每根柱的上樣量為1mL。經(jīng)上樣、淋洗、洗脫，收集洗脫液，用氮?dú)獯蹈芍?mL，用流動(dòng)相定容至1mL，用液相色譜儀分離測(cè)定玉米赤霉烯酮的含量。A.1.2結(jié)果判定：玉米赤霉烯酮含量≥1500ng，為可使用商品。A.2柱回收率驗(yàn)證A.2.1在5mL的80%乙腈溶液-PBS（1:4，v:v）中加入9000ng玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，充分混勻。分別取同一批次3根免疫親和柱，每根柱的上樣量為1mL。經(jīng)上樣、淋洗、洗脫，收集洗脫液，用氮?dú)獯蹈芍?mL，用流動(dòng)相定容至1mL，用液相色譜儀分離測(cè)定玉米赤霉烯酮的含量。A.2.