飼料中玉米赤霉烯酮的測定 編制說明

《飼料中玉米赤霉烯酮的測定》編制說明（公開征求意見稿）一、工作簡況 （一）任務(wù)來源 （二）標(biāo)準(zhǔn)修訂背景 （三）工作過程 3二、國家標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù) 6（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則 6（二）標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容的確定 71標(biāo)準(zhǔn)修訂的目的和方法研制中必用的基礎(chǔ)信息 72液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的建立 82.1質(zhì)譜條件的確定 2.2液相色譜條件的確定 2.3氮吹溫度的考察與確認(rèn) 152.4樣品提取與凈化條件的確定 152.5標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性 2.6基質(zhì)效應(yīng)評價(jià) 2.7方法性能考察 203免疫親和柱凈化-高效液相色譜法的驗(yàn)證 323.1樣品的提取與凈化 323.2液相色譜參考條件 323.3標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍 323.4檢出限和定量限 333.5準(zhǔn)確度和精密度 354本標(biāo)準(zhǔn)方法適用性考察 36三、標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核驗(yàn)證情況，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期經(jīng)濟(jì)效果 38四、與國際、國外同類標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容的對比情況 38五、采標(biāo)情況，以及是否合規(guī)引用或采用國際國外標(biāo)準(zhǔn) 39六、與有關(guān)法律、法規(guī)的關(guān)系 39七、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù) 40八、涉及專利的有關(guān)說明 40九、貫徹國家標(biāo)準(zhǔn)的要求，以及組織措施、技術(shù)措施、過渡期和實(shí)施日期的建議等措施建議.40十、其他應(yīng)予說明的事項(xiàng) 40參考文獻(xiàn) 411一、工作簡況根據(jù)下達(dá)的2023年飼料工業(yè)國家標(biāo)準(zhǔn)復(fù)審修訂計(jì)劃項(xiàng)目，本標(biāo)準(zhǔn)修訂項(xiàng)目的編號為20233890-T-469，項(xiàng)目名稱為《飼定》，項(xiàng)目承擔(dān)單位為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院和上海市獸藥飼料檢測所，本標(biāo)（二）標(biāo)準(zhǔn)修訂背景飼料是人類的間接食品，飼料質(zhì)量的好壞以及是否安全，直接影響了畜禽的正常發(fā)育和健康成長，以及生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展和人類健康。當(dāng)前飼料安全及畜產(chǎn)品安全問題已經(jīng)引起全社會的關(guān)注。而飼料中存在的真菌毒素是飼料安全的最大隱患之一。玉米赤霉烯酮是一種重要真菌毒素，主要污染玉米、小麥等飼料原料及產(chǎn)品，其具有類雌激素作用，主要作用引起動物繁殖機(jī)能異常甚至死亡。目前我國已在國家標(biāo)準(zhǔn)GB13078-2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了飼料中玉米赤霉烯酮的限量標(biāo)準(zhǔn)，系統(tǒng)制定飼料中玉米赤霉烯酮的國標(biāo)檢測方法，為飼料中玉米赤霉烯酮的用了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法精確測定玉米赤霉烯酮。而目前國標(biāo)方法GB/T2料，缺乏部分飼料原料以及精料補(bǔ)充料。因此需要進(jìn)一步制定完善液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測玉米赤霉烯酮的國家標(biāo)準(zhǔn)。國外，有關(guān)飼料中玉米赤霉烯酮的測定方法標(biāo)準(zhǔn)詳見表2。國際標(biāo)準(zhǔn)方面，其中ISO的兩個標(biāo)準(zhǔn)分別為提高飼料中玉米赤霉烯酮檢測效率，滿足我國飼料行業(yè)及企業(yè)的檢測需要，亟需對現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中玉米赤霉烯酮的測定》（GB/T薄層色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法，以此修訂形成新的國家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步規(guī)范飼料中玉米赤霉烯酮的測定方法標(biāo)準(zhǔn)，提升檢測效率，為飼料原料的開發(fā)123NY/T2071-201134567法8912法3456781成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作組42標(biāo)準(zhǔn)修訂進(jìn)展資料，同時(shí)調(diào)研國內(nèi)主要飼料質(zhì)檢機(jī)構(gòu)、飼料生產(chǎn)企業(yè)等標(biāo)準(zhǔn)方法的采用有關(guān)專家、主要起草人員召開標(biāo)準(zhǔn)修訂項(xiàng)目啟動會，確定標(biāo)準(zhǔn)修訂的主要 高效液相色譜法，針對飼料中玉米赤霉烯酮的液質(zhì)方法和儀器條件進(jìn)行優(yōu)化、并對所建立方法的線性、靈敏度、回收率和精密度等進(jìn)行驗(yàn)證，建立了不同飼料基質(zhì)中玉米赤霉烯酮的精準(zhǔn)檢測技術(shù)，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢意見稿，發(fā)省部級飼料質(zhì)檢機(jī)構(gòu)、大中型飼料企業(yè)實(shí)驗(yàn)室、全國飼料工業(yè)條。同時(shí)邀請農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（上海）、上海海關(guān)6動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、江蘇省畜產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測試中心三家單化工作組組織專家對上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院和上海市獸藥飼料檢測所起草的國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中玉米赤霉烯酮的測定》（預(yù)審稿）進(jìn)行了認(rèn)真審查。專家組由楊曙明、曲志娜、張麗英、樊霞、李云、吳銀良、吳寧鵬和張鳳枰組與會專家一致同意標(biāo)準(zhǔn)起草單位按照上述意見修改形成公開征求意見二、國家標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則按照GB/T20000.2－2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作指南第2部分采用國際標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定和要求編寫標(biāo)準(zhǔn)全文。查閱了國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施情況，以保證標(biāo)準(zhǔn)的先進(jìn)性和銜接性。建立的飼料中玉米赤霉烯酮的（二）標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容的確定1標(biāo)準(zhǔn)修訂的目的和方法研制中必用的基礎(chǔ)信息本次修訂擬結(jié)合國內(nèi)外玉米赤霉烯酮檢測技術(shù)發(fā)展趨勢和我國飼料行業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，開發(fā)應(yīng)用水平高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好的技術(shù)及方法，保證檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠，并提高檢測效率，全力滿足我國飼料中玉米赤霉烯酮的檢測需要。刪除GB/T19540-2收集查閱到的國內(nèi)外關(guān)于玉米赤霉烯酮檢測相關(guān)的文獻(xiàn)，開發(fā)建立液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，開展多種飼料基質(zhì)的方法學(xué)研究，考察方法的適用性和實(shí)際樣品測定的可操作性。本標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)對GB/T28716-2012中的免疫玉米赤霉烯酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化特性是在方法研究建立中必須考慮和應(yīng)用的基礎(chǔ)信息，其基本信息、化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)見圖2和表4。8C18H22O5試樣的制備均按GB/T14699-2023抽取有代表性的飼料樣品，用四分法縮2液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的建立質(zhì)譜儀中進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描（圖3），在電離過程中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了一個明質(zhì)譜氬氣，進(jìn)行二級掃描，比較其提取離子色譜圖的響應(yīng)和峰型（圖4進(jìn)行多次二級掃描考察穩(wěn)定性，此兩個子離子的信號強(qiáng)度依舊較高，因此選擇[M-H]﹣m/z317.2>131.1作為玉米赤霉烯酮的定性離子對，[M-H]﹣m/z比，發(fā)現(xiàn)定量離子對的選擇基本一致，定性離子對的選擇與歐盟標(biāo)準(zhǔn)EN168772016相一致。依次優(yōu)化氣流速、輔助氣、吹掃氣、離子傳輸溫度和霧化器溫度，然后優(yōu)化碰撞電壓，當(dāng)碰撞能達(dá)到24eV時(shí)，定量離子對）；），174.99131.01131.01187.00159.93146.99161.03112.96129.92173.89107.01103.00162.9895.00203.06213.06143.00135.04157.03149.00158.96187.99180.91189.01119.04219100110120130140150160170180190200210220最終確定質(zhì)譜儀器的方法參數(shù)如下：電離方式為電噴霧電離，負(fù)離子*用于定量測定玉米赤霉烯酮極性較弱，根據(jù)其結(jié)構(gòu)性質(zhì)以及飼料復(fù)雜的基質(zhì)情況，在方法研究過程中，試驗(yàn)比較了WatersACQUITYUPLCBEHC18(100霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液（圖7）。結(jié)果表明，三種色譜柱的峰型和分離度均較好，目標(biāo)物色譜峰附近無雜質(zhì)干擾，進(jìn)一步考察色譜峰面積（表6），發(fā)現(xiàn)使赤霉烯酮響應(yīng)最低（峰面積值為125451使用WatersACQUITYUPLCBEHC18(100mm×3mm，2.5μm)色譜柱時(shí)玉米赤霉烯酮的響應(yīng)有所提高（峰面積值為201254使用WatersACQU烯酮的色譜峰型最為尖銳，響應(yīng)最高（峰面積值為211479因此選擇HSS（高強(qiáng)度二氧化硅）顆粒技術(shù)，能提供出色能耐受100%水相，且耐受壓力高達(dá)18000psi，它還能提高保留率，因此可作為開發(fā)極性和非極性化合物分離方法的理想化效率，從而影響靈敏度。本實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈-水、乙腈-5mmol/L乙相比于乙腈-5mmol/L乙酸銨水溶液體系，0458根據(jù)玉米赤霉烯酮的理化性質(zhì)，其具有一種酚的二羥基苯酸的內(nèi)酯結(jié)氯仿、二氯甲烷等溶劑。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)與其余相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中真菌毒素的提取方法，本試驗(yàn)主要考察的提取試劑為甲醇、乙腈以及不同比例的乙腈水混向其添加標(biāo)準(zhǔn)溶液使最終加標(biāo)濃度為50μg/kg，用5種提取溶液分別進(jìn)行提取操作，平行試驗(yàn)三次，過濾膜上機(jī)測試，計(jì)算回收率，所得結(jié)果如下濃度為50μg/kg，分別使用震蕩、超聲和混勻三種提取方式進(jìn)行提取，平時(shí)回收率最高，提取時(shí)間達(dá)到60分鐘時(shí)回收率反而下降，因此選擇超聲飼料基質(zhì)比較復(fù)雜，需要進(jìn)一步凈化，其最主要的雜質(zhì)是油脂、蛋白質(zhì)等，考慮到玉米赤霉烯酮的理化性質(zhì)，結(jié)合文獻(xiàn)資料，主要考察了固相度為50μg/kg，分別使用不同的凈化小柱對空白飼料加標(biāo)樣品進(jìn)行凈化，），與真菌毒素分子具有高度親和性和專一性的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)待測樣品凈化和富集的凈化材料，其具有高特異性，相比傳統(tǒng)的固相萃取小柱和多功能凈化柱，使用免疫親和柱凈化可以獲得更為純凈的樣品提取物，結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜可以獲得準(zhǔn)確的定量檢測結(jié)果，因此本試驗(yàn)選擇免疫親和柱UptentC18UptentPSA飛測IAC柱本標(biāo)準(zhǔn)制修訂小組所在團(tuán)隊(duì)在接到制修訂任務(wù)前已經(jīng)開始對玉米赤霉每次試驗(yàn)時(shí)，分別精確吸取玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，逐級稀釋配次，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%。試驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)儲備（0天）（2月）（3月）（6月）（9月）RSD/%平均峰3948263953824091534077214175594211264230124016372.5本標(biāo)準(zhǔn)制修訂小組所在團(tuán)隊(duì)在接到制修訂任務(wù)前已經(jīng)開始對玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（10μg/mL）的穩(wěn)定性進(jìn)行了長期考察。根據(jù)確定的色譜質(zhì)譜條件，取配制好的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（10μg/mL），分別標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%。試驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)中間溶液在－18℃下保（0天）（2月）（3月）（6月）RSD/%平均峰面積2031692117441995271945121975942117443.2本標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)考察涉及小麥、玉米、仔豬配合飼料、育肥羊精料補(bǔ)充料、豬濃縮飼料共五種代表性飼料原料及飼料基質(zhì)。基質(zhì)效應(yīng)會影響高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的分析結(jié)果，出現(xiàn)信號抑制或者信號增強(qiáng)，采用初始流20動相和空白樣品基質(zhì)液分別稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，配制成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液?；|(zhì)效應(yīng)通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的比值（百分比）圍為51.2%-76.0%，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線消除基取基質(zhì)空白試樣，經(jīng)提取凈化得到空白基質(zhì)溶液，取標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適質(zhì)譜儀測定，以定量離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各種基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍及相關(guān)系21ResponseResponseResponseResponseResponseResponse22ResponseResponseCompoundname:ZENCorrelationcoefficient:r=0.999321,r^2=0.998642Calibrationcurve:636.215*x+988.097Responsetype:ExternalStd,AreaCurvetype:Linear,Origin:Exclude,Weighting:1/x,Axistrans:None0000000000三5000025000500002500075000-0Conc-01020304050607080901001101201301401501601701801902002.7.2檢出限和定量限飼料基質(zhì)復(fù)雜，因此本試驗(yàn)選擇小麥、玉米、仔豬配合飼料、育肥羊精料補(bǔ)充料和豬濃縮飼料共五種飼料作為考察對象。在上述空白飼料中添加一定濃度的玉米赤霉烯酮，按照本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)。以當(dāng)色譜峰的信噪比2324），），），25），），），本方法采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法考察了玉米赤霉烯酮在小麥、玉米、玉米DDGS、噴漿玉米皮、玉米漿干粉、仔豬配合飼料、育肥羊精料補(bǔ)充及GB/T23182-2008《飼料中獸藥及其他化學(xué)物檢測試驗(yàn)規(guī)程》等標(biāo)準(zhǔn)，考慮本試驗(yàn)添加回收水平需包括定量限及規(guī)定限量，確定了玉米基質(zhì)的添26行試驗(yàn)考察批內(nèi)精密度，進(jìn)行5個不同批次的試驗(yàn)考察批間精密度，發(fā)現(xiàn)內(nèi)精密度在1.4%~9.4%之間，批間精密度在2.9%~9.5%之間，具體結(jié)果見27(μg/kg)測定批次回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ28(μg/kg)測定批次回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ29(μg/kg)測定批次回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ30(μg/kg)測定批次回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ31(μg/kg)回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ323免疫親和柱凈化-高效液相色譜法的驗(yàn)證提取劑，于振蕩器上振蕩60min，或于高速均質(zhì)器均質(zhì)2min后，用定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取10.0mL濾液并加入40.0mLPBS溶液稀釋，用玻璃慢通過免疫親和柱，抽干。分別以10.0mL純水淋洗柱子兩次（對顏色較），3334 0.002.004.006.00分鐘0.800.60 0.400.200.00 -0.200.002.004.006.008.0010.0012.00分鐘35 4.00 2.00 0.002.004.006.00分鐘高效液相色譜法用于檢測飼料中的玉米赤霉烯酮，考察方法準(zhǔn)確度和綜上所述，通過對標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證以及在玉米、玉米DDGS、噴漿玉米皮、玉米漿干粉、羊精料補(bǔ)充料和豬配合飼料中添加回收率、準(zhǔn)確度和精密度的驗(yàn)證，證明了高效液相色譜法能繼續(xù)適用于飼料中玉米赤霉烯酮36濃度 率RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ4本標(biāo)準(zhǔn)方法適用性考察對本標(biāo)準(zhǔn)中兩種測試方法以及NY/T2071-2011標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了方法適37用性考察并對結(jié)果進(jìn)行了對比分析，選擇了包含飼料原料、配合飼料、濃），/MS法NY/T1/2/3/456/789///38三、標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核驗(yàn)證情況，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期經(jīng)濟(jì)效果海）、上海海關(guān)動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、江蘇省畜產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測試中心共三家有資質(zhì)的檢測機(jī)構(gòu)對該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證，不同實(shí)驗(yàn)室間國標(biāo)修訂版修改完善了飼料中玉米赤霉烯酮的測定方法，刪除了薄層串聯(lián)質(zhì)譜法，為定量和定性提供了依據(jù)。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，采用《飼料中玉米赤霉烯酮的測定》規(guī)定的方法測定飼料中玉米赤霉烯酮，方法重復(fù)性好，精密度符合標(biāo)準(zhǔn)要求，能滿足飼料原料、配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充玉米赤霉烯酮是飼料質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。修訂其測定的國家標(biāo)準(zhǔn)方法，對于規(guī)范飼料原料生產(chǎn)、提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全水平、加強(qiáng)飼料質(zhì)量安全監(jiān)管具有重要意義，保障了我國畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，有助于推動畜牧產(chǎn)業(yè)和畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)快速健康發(fā)展。本標(biāo)準(zhǔn)作為飼料質(zhì)量安全基礎(chǔ)性標(biāo)準(zhǔn)，建議四、與國際、國外同類標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容的對比情況17194:2019進(jìn)行比較，選取空白玉米粉和豬配合飼料樣品加標(biāo)（20μg/kg和100μg/kg）進(jìn)行回收率考察，結(jié)果見下表25，本39方法定量限（10μg/kg）低于歐盟標(biāo)準(zhǔn)EN17194:20），五、采標(biāo)情況，以及是否合規(guī)引用或采用國際國外標(biāo)準(zhǔn)六、與有關(guān)法律、法規(guī)的關(guān)系格執(zhí)行強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。與相關(guān)的各種基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)相銜接，遵循了政策性和協(xié)調(diào)同一性的原則。本文件制定過程中參考了GB13078-2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中玉米赤霉烯酮在各類飼料原料及飼料產(chǎn)品40七、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)八、涉及專利的有關(guān)說明九、貫徹國家標(biāo)準(zhǔn)的要求，以及組織措施、技術(shù)措施、過渡期和實(shí)施日期的建議等措施建議飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會組織標(biāo)準(zhǔn)起草單位通過標(biāo)準(zhǔn)培訓(xùn)、會議宣貫、十、其他應(yīng)予說明的事項(xiàng)41參考文獻(xiàn)[7]DB42/T808-2012中華人民共和國湖北省地方標(biāo)準(zhǔn)《飼料中黃曲霉毒素B1、玉[8]DB37/T4045.2-2020中華人民共和國山[10]謝瑜杰,陳輝,胡雪艷,等.QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[11]李洪波,宋志超,陳薔,等.[12]宋月,楊麗君,吳平谷,等.復(fù)合柱凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定糧油中42[15]