飼料中氨基酸的測(cè)定高效液相色譜法

《飼料中氨基酸的測(cè)定高效液相色譜法》河南省地址標(biāo)準(zhǔn)編制說明一、編制的目的和意義氨基酸是羧酸碳原子上的氫原子被氨基取代后的化合物，氨基酸分子中含有基和氨羧基兩種官能團(tuán)。與羥基酸類似，其可依照氨基連在碳鏈上的不同位置而分為α-，β-，γ-...w-氨基酸，但經(jīng)蛋白質(zhì)水解后取得的氨基酸都是α-氨基，它們是組成動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的大體物質(zhì)，是維持動(dòng)物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其種類和含量是評(píng)判飼料蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的全然指標(biāo)，測(cè)定飼料中的氨基酸具有超級(jí)重要的意義。隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅猛進(jìn)展，對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成份分析也提出了更高的要求。飼料分析已從比較單一的高含量營(yíng)養(yǎng)成份，如蛋白質(zhì)、脂肪等的總量分析，深切到比較復(fù)雜的微量營(yíng)養(yǎng)素，如多種氨基酸、維生素、微量元素及飼料中的有害物質(zhì)等分析。目前，飼料產(chǎn)品國(guó)標(biāo)中氨基酸的測(cè)定采納的是離子互換柱后茚三酮衍生色譜法。但眾所周知，該方式利用的氨基酸自動(dòng)分析儀價(jià)錢昂貴（約70萬(wàn)左右），專屬性強(qiáng)，只能分析氨基酸，且分析速度慢。而采納高效液相色譜法測(cè)定氨基酸，具有價(jià)錢廉價(jià)，分析速度快、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，第二，目前很多實(shí)驗(yàn)室都配置了高效液相色譜儀，其價(jià)錢易于同意（約10萬(wàn)左右），而且它的分析范圍很廣，可測(cè)定飼料中的氨基酸、維生素、碳水化合物、脂肪酸、有機(jī)酸、添加劑(風(fēng)味劑、防腐劑等)和有害物質(zhì)(如黃曲霉素、棉酚和農(nóng)藥殘留等)，因此實(shí)現(xiàn)了一機(jī)多用的可能。相較于目前國(guó)標(biāo)方式GB/T18246-2000《飼料中氨基酸的測(cè)定》規(guī)定的氨基酸分析方式，高效液相那么具有較好的通用性，應(yīng)用范圍廣且市場(chǎng)占有率高，利于推行。隨著高效液相色譜技術(shù)的日趨成熟和普及，高效液相色譜法必將成為各檢測(cè)機(jī)構(gòu)測(cè)定氨基酸含量的要緊方式。任務(wù)來源及編制原那么和依據(jù)任務(wù)來源依照河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局文件《河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局關(guān)于下達(dá)2017年第四批河南省地址標(biāo)準(zhǔn)制修訂打算的通知》豫質(zhì)監(jiān)標(biāo)發(fā)〔2017〕355號(hào)的要求，由河南海瑞正檢測(cè)技術(shù)負(fù)責(zé)對(duì)項(xiàng)目編號(hào)為667的河南省地址標(biāo)準(zhǔn)《飼料中氨基酸的測(cè)定高效液相色譜法》的起草、制定工作。編制原那么本標(biāo)準(zhǔn)編制符合國(guó)家法律、法規(guī)和政策，本著嚴(yán)格遵循“標(biāo)準(zhǔn)性、有效性、統(tǒng)一性、和諧性、完整性”的原那么，開展了本次研究工作，填補(bǔ)檢測(cè)方式單一的空白，并注重標(biāo)準(zhǔn)的可操作性。編制依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)在編制進(jìn)程中參照的要緊標(biāo)準(zhǔn)及依據(jù)如下：GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方式GB10648飼料標(biāo)簽GB/T飼料采樣GB/T18246-2000飼料中氨基酸的測(cè)定GB19489實(shí)驗(yàn)室生物平安通用要求編制進(jìn)程2017年11月9日,收到河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局下達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)制修訂通知，本標(biāo)準(zhǔn)被列入2017年第四批河南省地址標(biāo)準(zhǔn)制修訂打算。收到制定打算后，作為項(xiàng)目主持單位，河南海瑞正檢測(cè)技術(shù)成立了標(biāo)準(zhǔn)起草小組。小組成員經(jīng)充分討論和醞釀，制訂了實(shí)施方案，就起草工作進(jìn)行調(diào)研、匯總、分析、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、制定標(biāo)準(zhǔn)框架、起草標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)度等內(nèi)容，進(jìn)行了明確的分工。2017年12月標(biāo)準(zhǔn)起草小組相關(guān)人員就著手搜集了飼料中氨基酸的測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)、書籍資料等，并分門別類整理出了有關(guān)方面的研究論文、技術(shù)文獻(xiàn)資料。依照標(biāo)準(zhǔn)制定相關(guān)要求，考慮與現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的一致性原那么，重點(diǎn)研究國(guó)內(nèi)外有關(guān)飼料中氨基酸檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)體系。2018年1月～3月，標(biāo)準(zhǔn)編寫小組編寫制定整理出了標(biāo)準(zhǔn)編寫所需的資料，為起草標(biāo)準(zhǔn)作出了多方面的預(yù)備。與此同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室相關(guān)人員按打算進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證工作。2018年4月，標(biāo)準(zhǔn)編寫小組對(duì)有關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行了梳理總結(jié)，同時(shí)召開了標(biāo)準(zhǔn)起草小組會(huì)議，對(duì)編寫提綱進(jìn)行了討論，標(biāo)準(zhǔn)編制嚴(yán)格依照《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)那么》（GB/T）關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)定等要求進(jìn)行，初步確信了標(biāo)準(zhǔn)框架。依如實(shí)驗(yàn)資料和所有參與實(shí)驗(yàn)人員意見，在科學(xué)分析的基礎(chǔ)上，組織有關(guān)專家規(guī)定了適用范圍、標(biāo)準(zhǔn)性引用文件、方式原理、設(shè)備材料、測(cè)定步驟、結(jié)果的表述、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定等，起草了標(biāo)準(zhǔn)草案。2018年5月，標(biāo)準(zhǔn)起草單位將標(biāo)準(zhǔn)草案送至飼料中氨基酸檢測(cè)的有關(guān)專家學(xué)者征求意見，編制出了《河南省地址標(biāo)準(zhǔn)征求意見匯總表》。2018年6月，標(biāo)準(zhǔn)起草小組依照征求專家學(xué)者反饋的指導(dǎo)意見，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草案的每一組數(shù)據(jù)、每一句表述進(jìn)行了認(rèn)真而全面的補(bǔ)充、調(diào)整和完善，并經(jīng)多次小組討論最終形成《飼料中氨基酸的測(cè)定高效液相色譜法》征求意見稿并完成上報(bào)工作。要緊起草人及其任務(wù)分工：項(xiàng)目主持人：蘭尊海，河南海瑞正檢測(cè)技術(shù)，主持本項(xiàng)地址標(biāo)準(zhǔn)的制定與編寫。要緊起草人：蘭尊海：河南海瑞正檢測(cè)技術(shù)，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制定和技術(shù)推行。單慧燕：河南海瑞正檢測(cè)技術(shù)，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制定和應(yīng)用。易善平：河南海瑞正檢測(cè)技術(shù)，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制校訂和應(yīng)用。薛寧：河南海瑞正檢測(cè)技術(shù)，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制定。許亞楠：河南海瑞正檢測(cè)技術(shù)，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的校訂和應(yīng)用。李培娜：河南海瑞正檢測(cè)技術(shù)，負(fù)責(zé)此標(biāo)準(zhǔn)方式的應(yīng)用。孫世雯：河南海瑞正檢測(cè)技術(shù)，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)校訂和應(yīng)用。要緊內(nèi)容的確信（一）與國(guó)標(biāo)方式GB/T18246-2000《飼料中氨基酸的測(cè)定》的對(duì)照：1.出峰時(shí)刻進(jìn)行比較依照標(biāo)準(zhǔn)要求，用高效液相色譜法和國(guó)標(biāo)方式GB/T18246-2000《飼料中氨基酸的測(cè)定》，對(duì)氨基酸樣品進(jìn)行分析，出峰時(shí)刻如圖一、圖2所示，氨基酸分析儀出峰完全在110min左右，而高效液相色譜法的出峰時(shí)刻在36min左右，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)刻，提高了工作效率。圖1氨基酸自動(dòng)分析儀-氨基酸色譜圖圖2高效液相色譜法-17種氨基酸色譜圖2.結(jié)果準(zhǔn)確性進(jìn)行比較選用濃縮料和脫脂魚粉兩類飼料樣品，別離進(jìn)行本方式和國(guó)標(biāo)方式GB/T18246-2000《飼料中氨基酸的測(cè)定》，兩種方式進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果從表1能夠看出，兩組數(shù)據(jù)的相對(duì)偏不同離為%、%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)要求%的相對(duì)誤差，說明高效液相測(cè)定氨基酸結(jié)果準(zhǔn)確靠得住，方式可行。表1兩種方式氨基酸的測(cè)定結(jié)果組分名稱本標(biāo)準(zhǔn)GB/T18246本標(biāo)準(zhǔn)GB/T18246濃縮料脫脂魚粉天門冬氨酸（asp）谷氨酸（glu）絲氨酸（ser）精氨酸（arg）甘氨酸（gly）蘇氨酸（thr）脯氨酸（pro）丙氨酸（ala）纈氨酸（val）蛋氨酸（met）胱氨酸（cys）異亮氨酸（ile）亮氨酸（leu）苯丙氨酸（phe）組氨酸（his）賴氨酸（lys）酪氨酸（tyr）氨基酸總和相對(duì)偏差（%）（二）高效液相色譜法實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化：1.樣品前處置優(yōu)化條件酸解劑用量的優(yōu)化：別離取酸解劑5mL、10mL、15mL，由表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明酸解劑為5mL時(shí)，結(jié)果較低，說明水解不完全，在酸解劑用量為10mL和15mL時(shí)，結(jié)果一致，說明水解完全，本著節(jié)約的原那么，為減少浪費(fèi)，10mL為最正確酸解劑的用量。表2不同酸解劑用量測(cè)定結(jié)果組分名稱酸解劑（mL)51015天門冬氨酸（asp）谷氨酸（glu）絲氨酸（ser）精氨酸（arg）甘氨酸（gly）蘇氨酸（thr）脯氨酸（pro）丙氨酸（ala）纈氨酸（val）蛋氨酸（met）胱氨酸（cys）異亮氨酸（ile）亮氨酸（leu）苯丙氨酸（phe）組氨酸（his）賴氨酸（lys）酪氨酸（tyr）氨基酸總和2.衍生溫度的優(yōu)化:將衍生溫度設(shè)置為50℃、55℃、60℃、65℃、70℃五個(gè)梯度，其余參數(shù)同標(biāo)準(zhǔn)要求，結(jié)果如表3所示，衍生溫度在50℃到60℃時(shí)，結(jié)果處于上升趨勢(shì)，在60℃到65℃時(shí)，結(jié)果穩(wěn)固，在70℃時(shí)，結(jié)果明顯偏高，由此說明，溫度低于60℃時(shí)，衍生不完全，結(jié)果偏低；溫度高于65℃時(shí)，衍生試劑里的有機(jī)試劑易揮發(fā)，致使結(jié)果偏高。綜合考慮，衍生溫度選定在60℃時(shí)較為適合。表3不同衍生溫度測(cè)定結(jié)果組分名稱衍生溫度（℃)5055606570天門冬氨酸（asp）谷氨酸（glu）絲氨酸（ser）精氨酸（arg）甘氨酸（gly）蘇氨酸（thr）脯氨酸（pro）丙氨酸（ala）纈氨酸（val）蛋氨酸（met）胱氨酸（cys）異亮氨酸（ile）亮氨酸（leu）苯丙氨酸（phe）組氨酸（his）賴氨酸（lys）酪氨酸（tyr）氨基酸總和3.衍生時(shí)刻的優(yōu)化將衍生時(shí)刻設(shè)置為：20min、25min、30min、35min，結(jié)果如表4數(shù)據(jù)能夠看出，衍生時(shí)刻由20min到30min時(shí)，結(jié)果呈上升趨勢(shì)，說明衍生時(shí)刻低于30min時(shí)，衍生不完全，實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏低；衍生時(shí)刻為30min和35min時(shí)，結(jié)果相同，說明在30min時(shí)樣品已經(jīng)衍生完全，本著提高效率、節(jié)約資源的原那么，確信30min為最正確衍生時(shí)刻。表4不同衍生時(shí)刻實(shí)驗(yàn)結(jié)果組分名稱衍生時(shí)間（min)20253035天門冬氨酸（asp）谷氨酸（glu）絲氨酸（ser）精氨酸（arg）甘氨酸（gly）蘇氨酸（thr）脯氨酸（pro）丙氨酸（ala）纈氨酸（val）蛋氨酸（met）胱氨酸（cys）異亮氨酸（ile）亮氨酸（leu）苯丙氨酸（phe）組氨酸（his）賴氨酸（lys）酪氨酸（tyr）氨基酸總和4.方式周密度實(shí)驗(yàn)取試樣溶液一份，依照本標(biāo)準(zhǔn)要求的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果如表5所示,氨基酸各組分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差在%～%之間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：該方式測(cè)定氨基酸有較好的重復(fù)性。表5方式的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果組分名稱測(cè)定次數(shù)RSD(%)123456天門冬氨酸（asp）谷氨酸（glu）絲氨酸（ser）精氨酸（arg）甘氨酸（gly）蘇氨酸（thr）脯氨酸（pro）丙氨酸（ala）纈氨酸（val）蛋氨酸（met）胱氨酸（cys）異亮氨酸（ile）亮氨酸（leu）苯丙氨酸（phe）組氨酸（his）賴氨酸（lys）酪氨酸（tyr）氨基酸總和與有關(guān)的法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)為新制訂的地址標(biāo)準(zhǔn)，在標(biāo)準(zhǔn)的制訂進(jìn)程中嚴(yán)格貫徹國(guó)家有關(guān)方針政策