HCN2陽性細(xì)胞在胃腸道的分布變化-第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報

1/1HCN2陽性細(xì)胞在胃腸道的分布變化-第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報HCN2陽性細(xì)胞在小鼠消化管肌間神經(jīng)叢內(nèi)的分布熊承杰，梅峰，韓鵑，田衍平，江忠勇，周德山（第三軍醫(yī)大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，重慶400038）摘摘要：

目的探討（問題1：

中文全稱?）(Asubtypeofchannelsofhyperpolarization-activatedcyclicnucleotide-gatedfamily,HCN2)陽性細(xì)胞在小鼠胃腸道肌間神經(jīng)叢的分布。

方法成年昆明小鼠的胃腸道，包括胃、小腸、結(jié)腸，制作全層鋪片免疫細(xì)胞化學(xué)染色HCN2陽性細(xì)胞和膽堿能神經(jīng)及cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitialCajalcells,ICCs)。

結(jié)果成年小鼠胃腸道肌間神經(jīng)叢的HCN2陽性細(xì)胞成簇緊密排列，多數(shù)陽性細(xì)胞為DogielI型神經(jīng)元，陽性產(chǎn)物分別在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，每個神經(jīng)節(jié)內(nèi)可見數(shù)十個至數(shù)百個陽性細(xì)胞；神經(jīng)突起雖可見HCN2陽性產(chǎn)物，但主要存在于較粗的突起。

HCN2陽性神經(jīng)元分布密度在胃腸道各段差異較大：

結(jié)腸密度最高，胃次之，小腸比胃低；胃腸道的各截斷表達(dá)量也不一樣。

利用膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志物(ChAT,膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶)和ICCs的標(biāo)志物（c-kit蛋白）與HCN2進(jìn)行雙重免疫染色可見HCN2與膽堿能神經(jīng)元共存，而未見HCN2與ICCs共存。

結(jié)論HCN2離子通道廣泛表達(dá)于肌間神經(jīng)叢，存在于膽堿能神經(jīng)元，可能參與調(diào)控胃腸神經(jīng)的興奮性，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及胃腸道神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立。

關(guān)鍵詞：

HCN2；肌間神經(jīng)叢；膽堿能神經(jīng)；cajal間質(zhì)細(xì)胞；c-kit中圖法分類號：

R322.8；R329.1ThedistributionofimmunoreactivecellsforHCN2inthemyentericnerveplexusofdigestivetractofmiceAbstract:Objectivetoinvestigatethedistributionofimmunoreactive(IR)cellsforHCN2,whichisonesubtypeofchannelsofhyperpolarization-activatedcyclicnucleotide-gatedfamily,inthemyentericnerveplexusofgastrointestinaltractofmice.Methods:gastrointestinaltractsamples,whichincludestomach,smallintestineandcolon,frommatureKMmicewerecollectedforthepreparationofwhole-mountpreparationsexaminedbyimmunocytochemistryforIRcellsforHCN2andCholinergicnervesandICCs.ResultsMostofIRcellsforHCN2withinthemyentericplexusofmaturemicewereDogielItype-neuronsandIRproductsoccurredonthecellmembranesandcytoplasm.theyoftengatheredinclusterintheganglia,whichcontainsdozenstohundredsofIRcellsforHCN2.IRproductscanalsobeseenonnervousprocess,butmajorityoccurredonthosewhichwerethicker.ThedensityofdistributionforIRcellsforHCN2inthegastrointestinaltractisdifferent::colonishighest,stomachislowerthancolon,smallintestineislowest,andquantityofexpressionofeachcutofgastrointestinaltractisalsodifferent.ThemarkersofCholinergicnerves(ChAT)andICCs(c-kit)wereusedtodouble-immunostainingwithHCN2,collocationofHCN2positivenervesandCholinergicnervescanbefound,butnocollocationofHCN2positivenervesandICCscanbefound.conclusionHCN2channelsarewidelydistributedinthemyentericnerveplexusandexpressonCholinergicnerves.HCN2maybeinvolvedinregulationofexcitabilityofnervous，releaseofneurotransmitterandestablishmentofnetworkofnervousofgastrointestinaltract.Keywords:HCN2;MyentericNervePlexus;Cholinergicnerves;interstitialcellsofcajal;c-kit問題2：

刪去概念性的文字，壓縮前言至500字以內(nèi)。

超級化激活環(huán)核苷酸調(diào)控的陽離子通道（hyperplarzation－activatedcyclicnucleotide－gatedcationchannel,HCN）表達(dá)于心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、視網(wǎng)膜和背根神經(jīng)節(jié)等。

根據(jù)不同的電生理學(xué)特性，如通道被激活的速度、電壓依賴性以及受cAMP的調(diào)控程度等，HCN可以被分4個亞型（HCN1-4）。

各亞型表達(dá)部位不完全相同，HCN1表達(dá)于光感受器、背根神經(jīng)節(jié)等，HCN2表達(dá)于竇房結(jié)、背根神經(jīng)節(jié)、基底神經(jīng)節(jié)，HCN3廣泛表達(dá)于大腦，但表達(dá)量低，HCN4主要表達(dá)于心臟竇房結(jié)和皮層下區(qū)域等[1]。

HCN通道為四聚體結(jié)構(gòu)，可由同種亞型組成同源四聚體（homomers），也可以由不同亞型組成異源四聚體（heteromultimericchannels）。

兩者間在電生理學(xué)特性存在顯著差異，如HCN1和HCN2組成的異聚體與單獨(dú)由HCN1或HCN2組成的同聚體的電壓依賴性、及對cAMP的反應(yīng)程度等均有明顯差異[2]。

HCN通道參與機(jī)體許多重要生理功能的調(diào)節(jié)，如維持心臟自主節(jié)律的起搏活動、調(diào)節(jié)神經(jīng)元的功能活動，參與突觸遞質(zhì)釋放等神經(jīng)信號傳遞調(diào)控[1]。

與其它類型的離子通道相比，HCN可被超級化激活、被胞內(nèi)環(huán)核苷酸（cAMP和cGMP）調(diào)控,可將胞內(nèi)信號分子環(huán)核苷酸濃度變化轉(zhuǎn)化為膜電位的變化[1]。

另外，HCN通道允許K＋和Na＋以及少量的Ca2+通過，可被Cs2+和一些阻斷劑，如ZD7288阻斷。

據(jù)報道HCN2通道亦存在于小腸的肌間神經(jīng)叢[3]，但在胃腸道的分布規(guī)律和功能意義尚不清楚。

膽堿能神經(jīng)元是一種興奮性的運(yùn)動神經(jīng)元，廣泛分布于肌間神經(jīng)叢，能表達(dá)分泌多種化學(xué)物質(zhì)，包括鈣視網(wǎng)膜蛋白、神經(jīng)微絲蛋白、物質(zhì)P、五羥色胺等[4]。

膽堿能神經(jīng)元的功能多樣，包括支配平滑肌的興奮性運(yùn)動神經(jīng)元、內(nèi)在感覺神經(jīng)元、中間神經(jīng)元等[5]。

興奮性的運(yùn)動神經(jīng)元通過乙酰膽堿來傳遞信息，乙酰膽堿通過標(biāo)記膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT，分解乙酰膽堿）來識別。

HCN2表達(dá)于神經(jīng)元,但具體表達(dá)于何種類型的神經(jīng)元還少有報道，本實(shí)驗(yàn)通過闡明HCN2通道及膽堿能神經(jīng)在胃腸道肌間神經(jīng)叢內(nèi)的分布規(guī)律，為理解和研究HCN2通道在胃腸道生理功能中的作用提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

另外，ICCs是胃腸道的起搏細(xì)胞和興奮傳導(dǎo)細(xì)胞。

它可以產(chǎn)生一種自發(fā)性的起搏電流，使胃腸道產(chǎn)生自主起搏性活動；同時它還和胃腸道的神經(jīng)密切接觸，可以將胃腸神經(jīng)的信息傳遞給平滑肌細(xì)胞，調(diào)控胃腸道的活動[6]。

ICCs的起搏機(jī)制自今還未得到解釋。

HCN所形成的超級化電流可以引起的心臟的自動去極化，進(jìn)而產(chǎn)生自主起搏性活動。

HCN2被證明參與了小鼠心臟的自主起搏性活動[7]。

鑒于HCN2參與小鼠心臟自主節(jié)律調(diào)節(jié)，是否與胃腸起搏有關(guān)也是一個非常有趣的科學(xué)問題。

HCN2是否參與了胃腸道自主起搏活動還少有報道（有報道嗎？），本實(shí)驗(yàn)對HCN2通道及ICCs在胃腸道肌間神經(jīng)叢內(nèi)的分布規(guī)律進(jìn)行描述，為研究和推測ICCs在胃腸道的起搏機(jī)制有一定的意義。

1材料與方法1.1材料及標(biāo)本制備昆明小鼠（45～55d齡，雌雄不限，問題3：

來源？）27只，斷頸處死，無菌下開腹，將整個消化管取出，置于預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）中。

經(jīng)PBS反復(fù)沖洗去除內(nèi)容物后，100％丙酮充盈固定12h（4℃），將胃分為胃底、胃體、幽門部；小腸分為十二指腸、空腸、回腸；結(jié)腸分為升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸；解剖顯微鏡下分別制作肌間神經(jīng)叢附著的縱肌全層鋪片和粘膜下層含粘膜下神經(jīng)節(jié)的全層鋪片后，按間接法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)法染色。

1.2試劑兔抗HCN2抗體（1：

100，Alomone）、controlantigen（1：

100，Alomone）、鼠抗c-kit抗體（1：

100，DAKO）、山羊抗ChAT抗體（1：

100，chemicon）、羊抗兔IgGHRP酶標(biāo)抗體（1：

100，DAKO）、驢抗兔CY3抗體（1：

100，chemicon）、驢抗兔FITC抗體（1：

100，chemicon）、驢抗山羊FITC抗體（1：

100，chemicon）、兔抗小鼠CY3抗體（1：

100，DAKO）、DAB試劑盒（北京中杉金橋）。

1.3免疫細(xì)胞化學(xué)染色根據(jù)解剖學(xué)部位，分為胃底、胃體、胃竇、十二指腸、空腸、回腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸9個實(shí)驗(yàn)組，全層鋪片經(jīng)含0.5％Triton的0.01mol/LPBS漂洗后，0.3％H2O2甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物酶20min（25℃），1％BSA孵育30min，HCN2多克隆抗體孵育48h（4℃），PBS漂洗后，HRP酶標(biāo)羊抗兔IgG抗體孵育45min（25℃），PBS漂洗后，0.5%H2ODABTris緩沖液顯色，鏡下觀察，適時終止反應(yīng)，終產(chǎn)物為棕黃色。

對照試驗(yàn)，預(yù)先用HCN2對照抗原吸收一抗后代替一抗，孵育，結(jié)果為陰性。

免疫熒光法：

標(biāo)本處理同上，鋪片經(jīng)PBS漂洗后，1％BSA孵育30min，直接HCN2多克隆抗體孵育24h（4℃），但二抗為驢抗兔CY3熒光抗體，1h（25℃），PBS重復(fù)漂洗，DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察。

對照試驗(yàn)，同免疫酶標(biāo)染色。

免疫雙標(biāo)法：

鋪片先進(jìn)行HCN2染色，PBS重復(fù)漂洗后，加入一抗（山羊抗ChAT抗體）24℃24h，二抗（驢抗山羊FITC抗體），熒光顯微鏡和激光共聚交顯微鏡下分別用不同的激發(fā)波長觀察；鋪片先進(jìn)行ICCs染色，PBS重復(fù)漂洗后，加入一抗（兔抗HCN2抗體）24℃24h，二抗（驢抗兔FITC抗體），熒光顯微鏡和激光共聚交顯微鏡下分別用不同的激發(fā)波長觀察。

1.4半定量分析及統(tǒng)計學(xué)處理每部位選取HCN2細(xì)胞化學(xué)染色鋪片各3張，100倍視野下，每張鋪片上隨機(jī)（問題4：

具體的隨機(jī)方法？）選取9個視野，分別用Image-ProPlus5.1軟件進(jìn)行測量，以HCN陽性細(xì)胞與鋪片面積比為變量，采用SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果2.1HCN2陽性神經(jīng)為DogielI型神經(jīng)元HCN2多克隆抗體的間接免疫酶標(biāo)化學(xué)染色反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色。

全層鋪片可見胃腸道HCN2陽性產(chǎn)物反應(yīng)較強(qiáng)，主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，細(xì)胞核未著色，陽性細(xì)胞輪廓清晰，神經(jīng)突起著色不明顯。

陽性細(xì)胞直徑大小不等，數(shù)量從幾十個至上百個位于同一神經(jīng)節(jié)內(nèi)，連接于神經(jīng)節(jié)之間的節(jié)間束也為HCN2染色陽性，偶見少數(shù)HCN2染色陽性細(xì)胞位于節(jié)間束內(nèi)（圖1）。

胃內(nèi)HCN2陽性細(xì)胞較小，突起不明顯，細(xì)胞膜著陽性，未見細(xì)胞質(zhì)著色。

小腸內(nèi)HCN2陽性細(xì)胞較大，一部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜均陽性，另一部分細(xì)胞僅細(xì)胞膜陽性，形狀為圓形或者卵圓形，軸突細(xì)長,樹突不明顯，多為DogielI型神經(jīng)元。

結(jié)腸內(nèi)HCN2陽性細(xì)胞形態(tài)與小腸內(nèi)HCN2陽性細(xì)胞相似，較小腸內(nèi)細(xì)胞小。

圖1小腸肌間神經(jīng)叢的HCN2陽性神經(jīng)節(jié)問題5：

圖A為胃；圖C為結(jié)腸？2.2HCN2陽性神經(jīng)在小鼠胃腸道壁內(nèi)的分布規(guī)律胃內(nèi)的HCN2陽性神經(jīng)節(jié)數(shù)量較多，面積較小，多個神經(jīng)節(jié)間界限常不清，形狀不規(guī)則，節(jié)間神經(jīng)突起較短較少，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)稀疏，網(wǎng)狀分布，節(jié)內(nèi)細(xì)胞胞體較小，數(shù)量較多，排列致密；小腸內(nèi)HCN2陽性神經(jīng)節(jié)數(shù)量少，只有1到2個神經(jīng)節(jié)/mm2，面積大，呈長梭形分布，節(jié)間神經(jīng)突起較多，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)致密，節(jié)內(nèi)細(xì)胞胞體較大，數(shù)量較少，排列致密；結(jié)腸內(nèi)的HCN2陽性神經(jīng)節(jié)數(shù)量較多，面積較小，多個神經(jīng)節(jié)之間界限不清，呈長梭形，多沿平滑肌束呈平行排列，節(jié)間神經(jīng)突起豐富，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)致密，節(jié)內(nèi)細(xì)胞胞體較小，數(shù)量較多（圖2）。

統(tǒng)計結(jié)果顯示，從胃底到胃竇，HCN2陽性細(xì)胞增加；十二指腸HCN2陽性細(xì)胞最少，從十二指腸到回腸，HCN2陽性細(xì)胞增加；橫結(jié)腸的數(shù)目最多,升結(jié)腸和降結(jié)腸陽性細(xì)胞數(shù)相差不明顯（圖3）；在盲腸也發(fā)現(xiàn)了HCN2陽性神經(jīng)。

對照標(biāo)本均為陰性，預(yù)先用HCN2抗原吸收一抗后代替一抗，孵育，結(jié)果為陰性。

圖2HCN2陽性神經(jīng)在小鼠胃腸道各段的分布圖A、B、C、D、E、F、G、H分別代表胃底、胃體、胃竇、十二指腸、空腸、回腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸050100150200250300350400450500胃底胃體胃竇HCN2陽性神經(jīng)元數(shù)/mm2050100150200250十二指腸空腸回腸HCN2陽性神經(jīng)元數(shù)/mm20100200300400500600700800升結(jié)腸橫結(jié)腸降結(jié)腸HCN2陽性神經(jīng)元數(shù)/mm20200400600800胃小腸結(jié)腸HCN2陽性神經(jīng)有數(shù)/mm2圖3A、B、C、D分別顯示胃、小腸、結(jié)腸不同截斷單位面積陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)的變化。

圖A示胃底、胃竇，胃竇的陽性神經(jīng)元數(shù)，胃竇多于胃體（P0.05），胃體多于胃底（P0.05）。

圖B示，回腸的陽性神經(jīng)元數(shù)多于十二指腸和空腸的（P0.05），十二指腸和空腸沒有明顯差異。

圖C示，橫結(jié)腸的陽性細(xì)胞數(shù)最多，橫結(jié)腸的陽性細(xì)胞數(shù)多于升結(jié)腸和降結(jié)腸的（P0.05），升結(jié)腸和降結(jié)腸沒有顯著性差異。

圖D示，結(jié)腸的陽性細(xì)胞數(shù)多于胃的（P0.05），而胃又多于小腸的（P0.05）。

問題6：

可否用表格列舉出？2.3肌間神經(jīng)叢內(nèi)膽堿能神經(jīng)的分布模式ChAT顯色結(jié)果顯示：

膽堿能陽性神經(jīng)廣泛的分布于整個消化道的肌間神經(jīng)叢中，構(gòu)成神經(jīng)節(jié)、節(jié)間束及神經(jīng)纖維縱橫交織成網(wǎng)（圖5）。

膽堿能陽性神經(jīng)元輪廓較為清晰，形狀為圓形或者卵圓形，軸突細(xì)長,樹突不明顯，多為DogielI型神經(jīng)元；細(xì)胞質(zhì)著色，細(xì)胞核未觀察到著色，數(shù)十個至數(shù)百個膽堿能陽性神經(jīng)元成簇分布在神經(jīng)節(jié)中，數(shù)個膽堿能陽性神經(jīng)元散在分布在節(jié)間束上。

圖5橫結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的膽堿能神經(jīng)問題7：

A,B,C分別是什么？2.4HCN2陽性神經(jīng)與膽堿能神經(jīng)免疫熒光雙標(biāo)HCN2陽性神經(jīng)與膽堿能神經(jīng)免疫熒光雙標(biāo)的結(jié)果顯示：

HCN2陽性神經(jīng)和膽堿能神經(jīng)多為DogielI型神經(jīng)元。

HCN2陽性神經(jīng)元與膽堿能神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和突起均重合，HCN2陽性神經(jīng)節(jié)間的突起和膽堿能神經(jīng)的突起也重合（圖6）。

圖6膽堿能神經(jīng)和HCN2陽性神經(jīng)的共標(biāo)A：

膽堿能神經(jīng)；B：

HCN2陽性神經(jīng)；C：

膽堿能神經(jīng)和HCN2陽性神經(jīng)的共標(biāo)箭頭所示共標(biāo)的細(xì)胞質(zhì)和神經(jīng)突起2.5HCN2陽性神經(jīng)與ICC間質(zhì)細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)HCN2陽性神經(jīng)與ICCs免疫熒光雙標(biāo)的結(jié)果顯示：

全層鋪片可見c-kit陽性的ICC間質(zhì)細(xì)胞為梭形或卵圓形，細(xì)胞質(zhì)較少，細(xì)胞質(zhì)著色淺，有2～3個細(xì)長的突起，突起間形成完整的獨(dú)立的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)（圖7B）。

HCN2陽性神經(jīng)元聚集形成神經(jīng)節(jié)，與ICCs各自形成完整的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，未見兩者存在明顯的共存現(xiàn)象，僅見ICCs的突起與HCN2陽性神經(jīng)元有少量共標(biāo)（圖7C）。

圖7cajal間質(zhì)細(xì)胞與HCN2陽性神經(jīng)的共標(biāo)問題8：

圖7A文中未標(biāo)引？A：

HCN2陽性神經(jīng)；B：

ICC間質(zhì)細(xì)胞；C：

ICCs與HCN2陽性神經(jīng)的共標(biāo)B中箭頭示ICCs的胞體和突起，C中箭頭示ICCs的突起與HCN2陽性神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)共標(biāo)3討論HCN是一種特殊類型的陽離子通道，由超極化激活，環(huán)核苷酸調(diào)控。

活化后的HCN通道通過進(jìn)出的陽離子改變神經(jīng)元的興奮性、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、影響神經(jīng)元的可塑性和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育成熟。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，HCN與睡眠、醒覺等生理功能密切相關(guān)，同時它的功能失常與癲癇等疾病的發(fā)生也密切相關(guān)[8]。

HCN2通道表達(dá)于胃腸道神經(jīng)，但是國內(nèi)外對其在胃腸道具體的表達(dá)和分布模式還少有研究。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫細(xì)胞化學(xué)觀察HCN2陽性細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞膜均著色，輪廓清晰，神經(jīng)突起少，多數(shù)為DogielI型神經(jīng)元，廣泛地分布于胃腸道肌間神經(jīng)叢，且分布趨勢為結(jié)腸單位面積的陽性神經(jīng)元最多，胃次之，小腸最少。

我們同時對胃腸道各個截斷的具體分布情況進(jìn)行了比較發(fā)現(xiàn)，從胃底到胃竇，單位面積的陽性神經(jīng)元數(shù)有逐漸增加；從十二指腸到回腸，十二指腸和空腸單位面積的陽性神經(jīng)元數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異，而與回腸差異顯著；從升結(jié)腸到橫結(jié)腸，單位面積的陽性神經(jīng)元數(shù)顯著增加，而降結(jié)腸單位面積的陽性神經(jīng)元數(shù)又顯著減少。

我們的結(jié)果與國外學(xué)者研究神經(jīng)元在胃腸神經(jīng)系統(tǒng)的分布模式相似[9，10]。

可見HCN2通道在胃腸道多種類型的神經(jīng)元表達(dá)，而HCN通道具有高度的功能可塑性，可以適應(yīng)不同類型神經(jīng)元的功能變化。

盡管現(xiàn)在沒有直接證據(jù)證明HCN2通道在胃腸道功能中發(fā)揮作用，但是有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了HCN2參與了胃腸炎癥性疾病的異常放電。

根據(jù)不同的電生理學(xué)特性，胃腸道的神經(jīng)元可以分為兩種不同的類型，AH神經(jīng)和S神經(jīng)。

J.XIAO等在AH神經(jīng)記錄到了Ih(HCN通道產(chǎn)生的電流)，同時他們還對AH神經(jīng)進(jìn)行了標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了這些神經(jīng)都為HCN2陽性。

AH神經(jīng)元被證明在腸道炎癥的疾病動物模型中對調(diào)節(jié)神經(jīng)的興奮性發(fā)揮重要作用，在這一過程中，AH神經(jīng)被記錄到了Ih[11]，HCN2參與了AH神經(jīng)的異常放電現(xiàn)象，影響胃腸神經(jīng)的興奮性。

我們進(jìn)一步使用了ChAT對膽堿能神經(jīng)進(jìn)行標(biāo)記研究HCN2陽性神經(jīng)元與膽堿能神經(jīng)的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)所有通過ChAT標(biāo)記的膽堿能神經(jīng)的分布模式與HCN2陽性神經(jīng)一致，同時共標(biāo)結(jié)果顯示兩者高度重合。

由于膽堿能神經(jīng)是胃腸道的一種重要的神經(jīng)，它分化出多種功能，包括中間神經(jīng)、內(nèi)在感覺神經(jīng)和支配平滑肌收縮的興奮性運(yùn)動神經(jīng)；根據(jù)表達(dá)鈣結(jié)合蛋白（calciumbindingproteins）的種類不同，它還可以被分為表達(dá)鈣視網(wǎng)膜蛋白（calretinin）和鈣結(jié)合蛋白（calbindin）的兩種膽堿能神經(jīng)[5]。

XIAO等發(fā)現(xiàn)鈣視網(wǎng)膜蛋白（calretinin）陽性神經(jīng)在遠(yuǎn)端結(jié)腸全部表達(dá)HCN2,然而只有33％的HCN2陽性神經(jīng)表達(dá)鈣視網(wǎng)膜蛋白[3]。

J.XIAO的結(jié)果證實(shí)了HCN2在部分膽堿能神經(jīng)的表達(dá)。

基于J.XIAO的觀察結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相似，推測HCN2通道可能與胃腸道生理功能有一定的關(guān)系。

HCN通道具有高度的功能可塑性，這種可塑性可能是膽堿能神經(jīng)功能多樣性的分子基礎(chǔ)。

另外，在這些神經(jīng)中，HCN2通道主要位于軸突終末，還可能調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[8]。

我們沒有發(fā)現(xiàn)ICCs與HCN2神經(jīng)元共標(biāo),ICCs與HCN2陽性神經(jīng)各自形成獨(dú)立的網(wǎng)絡(luò)，僅見ICCs的突起與HCN2有少量共標(biāo)，并未發(fā)現(xiàn)ICCs的胞體與HCN2共標(biāo)。

HCN2表達(dá)于神經(jīng)元，參與神經(jīng)元的電活動，調(diào)控神經(jīng)元的興奮性，介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

而ICCs作為胃腸道的起搏細(xì)胞，產(chǎn)生起搏電流，引起胃腸道的自主節(jié)律性活動。

它與神經(jīng)元和平滑肌細(xì)胞關(guān)系密切，可以接受神經(jīng)元的信息并傳達(dá)到平滑肌細(xì)胞，對胃腸道的運(yùn)動功能進(jìn)行調(diào)控。

ICCs的突起與HCN2陽性神經(jīng)元共同表達(dá)HCN2通道，而胞體并未表達(dá)HCN2通道，可能是HCN2陽性神經(jīng)元通過ICCs的突起對ICCs的電活動進(jìn)行調(diào)控，或者將神經(jīng)元的信息通過ICCs傳遞給胃腸道的平滑肌細(xì)胞。

最近有研究顯示HCN通道對于神經(jīng)元的發(fā)育和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立至關(guān)重要。

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)成熟的過程需要發(fā)育中的神經(jīng)元不斷的調(diào)節(jié)自身的特性以及它們的放電行為來適應(yīng)不斷變化的神經(jīng)元微環(huán)境，HCN通道高度的功能可塑性尤其適合這個過程。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，由不成熟階段的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)發(fā)育到成熟階斷的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)伴隨著HCN表達(dá)量的變化[8]。

HCN參與了體內(nèi)一系列的生理、病理過程，與神經(jīng)功能的建立、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成以及神經(jīng)元的興奮性密切相關(guān)，我們認(rèn)為HCN2在胃腸道的生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)通過對HCN2在胃腸道的分布模式進(jìn)行詳細(xì)研究，為深入探討胃腸道生理功能提供了新的形態(tài)學(xué)依據(jù)，對理解臨床胃腸道相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要的理論意義。

問題9：

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參考文獻(xiàn)：

問題10：

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