熒光定量PCR和FISH技術(shù)診斷肺結(jié)核的價(jià)值比較

熒光定量PCR和FISH技術(shù)診斷肺結(jié)核的價(jià)值比較摘要】目的比較熒光定量PCR和FISH技術(shù)對(duì)肺結(jié)核診斷的敏感性和特異性。方法共收集300例明確診斷為肺結(jié)核的患者作為陽性對(duì)照組，以及收集300例健康志愿者（明確排除肺結(jié)核患者）做為陰性對(duì)照組。收集800例新收臨床疑似肺結(jié)核患者做為研究組。收集該800例患者的肺活檢標(biāo)本以及同期的痰液標(biāo)本，其中痰液進(jìn)行涂片、結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)以及結(jié)核桿菌DNA熒光定量PCR檢測(cè)和FISH檢測(cè)。比較熒光定量PCR和FISH技術(shù)對(duì)肺結(jié)核診斷陽性符合率和陰性符合率。結(jié)果

①FISH技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌陽性符合率為99.3%；熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)核桿菌陽性符合率為97.3%。兩者陽性符合率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（p=0.015）。②FISH技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌陰性符合率為98.2%，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌陰性符合率為96.9%。兩者陰性符合率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（p=0.007）。結(jié)論與熒光定量PCR比較，F(xiàn)ISH對(duì)肺結(jié)核診斷具有較高的陽性符合率和陰性符合率。

【關(guān)鍵詞】肺結(jié)核熒光定量PCR熒光標(biāo)記原位雜交技術(shù)

doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2024.11.031

結(jié)核病被列為我國(guó)重大傳染病之一，是嚴(yán)重危害人民群眾健康的呼吸道傳染?。?-2］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病流行嚴(yán)重的國(guó)家之一，同時(shí)也是全球27個(gè)耐多藥結(jié)核病流行嚴(yán)重的國(guó)家之一［3］。近十余年來，隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展，以及檢測(cè)手段的提高、檢測(cè)軟件的不斷發(fā)展，基因診斷技術(shù)作為結(jié)核病非培養(yǎng)診斷技術(shù)是近年來結(jié)核病診斷的一項(xiàng)重大突破，具有特異、敏感、快速鑒定結(jié)核病的優(yōu)點(diǎn)。常規(guī)PCR技術(shù)、熒光定量PCR、巢式PCR等技術(shù)在結(jié)核病診斷中應(yīng)用的報(bào)道屢見不鮮。但PCR技術(shù)也存在不少的局限性，如由于該技術(shù)操作復(fù)雜，往往易造成細(xì)胞前處理受損，擴(kuò)增過程的非特異性，使得檢測(cè)信號(hào)微弱，不易辨識(shí)，造成假陽性、假陰性結(jié)果等［4-5］。熒光標(biāo)記原位雜交技術(shù)（FISH）是一種非放射性原位雜交技術(shù)，該技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了熒光定量PCR的不足之處，使之具有更深刻的應(yīng)用價(jià)值［6-7］。因此，本研究擬初步探討和比較熒光定量PCR技術(shù)和FISH技術(shù)對(duì)肺結(jié)核病診斷的敏感性和特異性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1研究方法

1.1研究對(duì)象

患者收集時(shí)間為2024年1月~2024年1月，共收集300例明確診斷為肺結(jié)核的患者做為陽性對(duì)照組，以及收集300例健康志愿者（明確排除肺結(jié)核患者）做為陰性對(duì)照組。收集800例新收臨床疑似肺結(jié)核患者做為研究組。收集該800例患者的肺活檢標(biāo)本以及同期的痰液標(biāo)本，其中痰液進(jìn)行涂片、結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)以及結(jié)核桿菌DNA熒光定量PCR檢測(cè)，肺活檢標(biāo)本經(jīng)過固定、脫水、包埋制成蠟塊，進(jìn)行切片抗酸染色及結(jié)核桿菌FISH檢測(cè)。

1.2研究方法

①探針的制備優(yōu)化：根據(jù)NCBI報(bào)道的人源結(jié)核桿菌基因序列，選取結(jié)核桿菌Ag85A基因（GenBank編號(hào)：NC-000962）及IS6110基因（GenBank編號(hào)：NC-002944）作為靶序列，結(jié)合運(yùn)用primer5.0、oligo6.0和Primerexpress2.0軟件，設(shè)計(jì)出兩組結(jié)核桿菌特異性探針引物（引物序列具體見表1），將兩組引物及其擴(kuò)展產(chǎn)物放入NCBI作BLAST進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示與其它基因序列異源，從而避免了雜交時(shí)非特異性的存在。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。②FISH檢測(cè)流程的優(yōu)化：操作方法參照《FluorescenceinSituHybridizationTechnology》(BarbaraBeatty等，美國(guó))，針對(duì)FISH技術(shù)關(guān)鍵步驟進(jìn)行反應(yīng)條件的摸索優(yōu)化。③所有800例試驗(yàn)組人群同時(shí)還進(jìn)行痰液涂片檢查、痰液結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)、痰液結(jié)核桿菌DNA熒光定量PCR檢測(cè)。

1.3熒光定量PCR檢測(cè)

使用達(dá)安基因股份有限公司的結(jié)核桿菌（TB）核酸擴(kuò)增PCR熒光檢測(cè)試劑盒（Cat.#DA-052），對(duì)痰液標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核桿菌核酸檢測(cè)，主要采用胰酶消化法對(duì)痰液標(biāo)本進(jìn)行消化處理，處理完成后提取結(jié)核桿菌基因組DNA，用熒光定量PCR進(jìn)行結(jié)核桿菌DNA的擴(kuò)增檢測(cè)，操作步驟按照試劑盒的說明進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

將痰液涂片檢查、痰液結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)、痰液結(jié)核桿菌DNA熒光定量PCR檢測(cè)、肺組織病理標(biāo)本抗酸染色、結(jié)核桿菌FISH檢測(cè)結(jié)果均為陽性者定義為陽性，結(jié)果均為陰性者定義為陰性，其他情況均定義為可疑。①陽性符合率：依據(jù)上述定義，結(jié)核桿菌FISH檢測(cè)的陽性符合率=結(jié)核桿菌FISH檢測(cè)陽性數(shù)/所有標(biāo)本檢測(cè)陽性數(shù)。②陰性符合率依據(jù)上述定義，結(jié)核桿菌FISH檢測(cè)的陰性符合率=結(jié)核桿菌FISH檢測(cè)陰性數(shù)/所有標(biāo)本檢測(cè)陰性數(shù)。采用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，定性資料采用百分率表示，組間比較采用t-檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)，p2結(jié)果

2.1FISH技術(shù)和熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)核桿菌陽性符合率

300例明確診斷為肺結(jié)核患者，298例患者FISH檢測(cè)為陽性。另外800例臨床可疑為肺結(jié)核患者中，依據(jù)痰液涂片檢查、痰液結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)檢測(cè)診斷為肺結(jié)核患者共有378例，其中375例FISH結(jié)果為陽性，因此，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌陽性符合率為99.3%［（298+375）/（300+378）］。300例明確診斷為肺結(jié)核患者，290例患者熒光定量PCR檢測(cè)為陽性。另外800例臨床可疑為肺結(jié)核患者中，依據(jù)痰液涂片檢查、痰液結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)檢測(cè)診斷為肺結(jié)核患者共有378例，其中370例熒光定量PCR結(jié)果為陽性，因此，熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)核桿菌陽性符合率為97.3%［（290+370）/（300+378）］?？ǚ綑z驗(yàn)比較FISH技術(shù)和熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)得陽性符合率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（X2=3.678，p=0.015）。

2.2FISH技術(shù)和熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)核桿菌陰性符合率

300例明確排除肺結(jié)核患者中，有5例FISH檢測(cè)為陽性。另外800例臨床可疑為肺結(jié)核患者中，依據(jù)痰液涂片檢查、痰液結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)、痰液結(jié)核桿菌DNA熒光定量PCR檢測(cè)排除為肺結(jié)核患者共有422例，其中8例FISH結(jié)果為陽性，因此，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌陰性符合率為98.2%［（295+414）/（300+422）］。300例明確排除肺結(jié)核患者中，有9例熒光定量PCR檢測(cè)為陽性。另外800例臨床可疑為肺結(jié)核患者中，依據(jù)痰液涂片檢查、痰液結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)檢測(cè)排除為肺結(jié)核患者共有422例，其中13例熒光定量PCR結(jié)果為陽性，因此，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌陰性符合率為96.9%［（291+409）/（300+422）］?？ǚ綑z驗(yàn)比較FISH技術(shù)和熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)得陰性符合率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（X2=5.065，p=0.007）。

3討論

衛(wèi)生部全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，目前我國(guó)結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬，占全球發(fā)病的14.3%，位居全球第2位。2024~2024年，全國(guó)共發(fā)現(xiàn)和治療肺結(jié)核患者828萬例，其中傳染性肺結(jié)核患者450萬例［8－9］。結(jié)核病是一種慢性傳染病，其發(fā)病規(guī)律和流行特點(diǎn)決定了在今后相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)其危害將持續(xù)存在。傳統(tǒng)上診斷肺結(jié)核，有三種途徑：①痰液及病變組織中查出結(jié)核桿菌；②結(jié)核的病理組織常規(guī)檢查；③胸部X線檢查，但該方法不能確診肺結(jié)核，因?yàn)榉尾科渌膊。绶窝?、肺寄生蟲病、肺部腫瘤等病變也可出現(xiàn)類似肺結(jié)核病變的肺部X線影像學(xué)表現(xiàn)，單憑X線檢查，許多患者會(huì)誤診誤治，不但給患者造成經(jīng)濟(jì)上的損失，還會(huì)導(dǎo)致病情惡化。

熒光定量PCR技術(shù)和FISH技術(shù)是近年來新開展的用于檢測(cè)肺結(jié)核的新技術(shù)，但兩種技術(shù)對(duì)肺結(jié)核診斷的陽性符合率和陰性符合率是否存在差別目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，熒光定量PCR技術(shù)和FISH技術(shù)均具有較高的陽性符合率和陰性符合率［10-11］。以此同時(shí)，與熒光定量PCR技術(shù)相比較，F(xiàn)ISH技術(shù)的陽性符合率和陰性符合率更高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們認(rèn)為這可能與如下因素有關(guān)［12-15］：（1）熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)核桿菌作為快速診斷技術(shù)已普遍應(yīng)用于臨床，具有高特異性和敏感性，由于該技術(shù)操作復(fù)雜，往往易造成細(xì)胞前處理受損，擴(kuò)增過程的非特異性，使得檢測(cè)信號(hào)微弱，不易辨識(shí)，造成假陽性、假陰性結(jié)果；（2）FISH技術(shù)是一種非放射性原位雜交技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；②探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；③實(shí)驗(yàn)周期短，能迅速得到結(jié)果，特異性好，定位準(zhǔn)確；④FISH可定位長(zhǎng)度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；⑤多色FISH通過在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列；⑥針對(duì)染色體的檢查既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法以及熒光定量PCR比較，F(xiàn)ISH對(duì)肺結(jié)核診斷具有較高的陽性符合率和陰性符合率，值得臨床推廣。

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