CO2氣腹對大鼠腹膜炎細菌生長及移位的影響

1/1CO2氣腹對大鼠腹膜炎細菌生長及移位的影響CO2氣腹對大鼠腹膜炎細菌生長及移位的影響歐夢川1，羅云1，王崇樹1,21.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院普外一科（四川南充文化路63號637000）；2.川北醫(yī)學院肝膽胰腸研究所（四川南充涪江路234號637000）[摘要]目的研究不同氣腹壓力及作用時間對大鼠腹膜炎腹腔感染細菌的生長繁殖和細菌移位的影響。

方法大鼠腹腔內(nèi)注射大腸桿菌標準混懸液，建立大鼠急性細菌性腹膜炎模型，60只SD大鼠隨機分為6組，通過不同二氧化碳氣腹壓力及時間處理后，分別取腹水進行細菌定量培養(yǎng)和菌種分離鑒定，對門靜脈血進行血培養(yǎng)和內(nèi)毒素測定。

結(jié)果經(jīng)過氣腹處理3小時后，高氣腹組與對照組，低氣腹組與對照組相比，細菌CFU濃度有顯著性升高（P0.05）;高氣腹組血培養(yǎng)陽性率高于對照組（P0.05）;高氣腹組內(nèi)毒素含量高于低氣腹組（P0.05），低氣腹組內(nèi)毒素含量高于對照組（P0.05）；腹水及血培養(yǎng)中都培養(yǎng)出了腸道常見定植需氧及厭氧細菌。

結(jié)論二氧化碳氣腹促進了腹膜炎大鼠的腸道內(nèi)毒素和細菌移位，并且隨壓力和時間的增加而升高。

二氧化碳氣腹環(huán)境促進了腹水細菌的生長，以厭氧細菌的增加為主，總的細菌數(shù)量比無氣腹的環(huán)境明顯增加。

腹腔鏡手術(shù)目前正在全球范圍內(nèi)迅速普及，從最初的膽囊切除術(shù)逐漸擴展至其他學科領(lǐng)域，其中包括了很多感染性疾病在內(nèi)，如化膿性闌尾炎、急性膽囊炎、重癥急性膽管炎、結(jié)核性腹膜炎、胃腸道穿孔等。

相比開放性手術(shù)，腹腔鏡手術(shù)具有創(chuàng)傷小、全身反應(yīng)輕、恢復(fù)快、美容等優(yōu)勢。

二氧化碳是目前較常用的創(chuàng)建氣腹的氣體，其對機體各個系統(tǒng)以及炎癥反應(yīng)影響的研究也較多，但對腹膜炎的影響并沒有達成一致的共識。

腹腔鏡手術(shù)的微創(chuàng)性，能更好的保護機體的全身免疫系統(tǒng)，減輕全身的炎癥反應(yīng)，但同時，二氧化碳氣腹也會導(dǎo)致局部腹膜免疫功能的抑制[1]。

有不少實驗也驗證了二氧化碳氣腹增加了菌血癥的發(fā)生幾率[2]，但同時也在動物實驗中觀察到，相比開放性手術(shù)，氣腹組在腹腔感染模型中顯著延長了大鼠的生存率[3]。

臨床資料研究也對氣腹使腹腔感染擴散的推論予以否定，許多感染性疾病也通過腹腔鏡手術(shù)得到了很好的治療，并沒有見到這些感染性疾病出現(xiàn)感染加重或并發(fā)癥的情況[4]。

本實驗，將在大鼠腹膜炎模型的基礎(chǔ)上，通過形成不同時間及不同壓力的CO2氣腹，研究氣腹壓力對腹膜炎細菌的生長繁殖和移位的影響，確定是否二氧化碳氣腹增加了敗血癥的發(fā)生幾率。

材料與方法一、實驗動物實驗動物采用SD大鼠（由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供），雌雄不限，體重范圍在200-250之間。

二、主要試劑及器材Stryker全自動氣腹機（川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院提供），梅里埃VITEK2全自動細菌鑒定儀，龐通公司處購入哥倫比亞血瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)平板，金山川公司提供MB80微生物動態(tài)檢測系統(tǒng)和革蘭陰性菌脂多糖檢測試劑盒。

三、建立急性腹膜炎模型將大鼠禁食禁水12小時，將大鼠上腹部處備皮，碘伏消毒皮膚，以1%戊巴比妥鈉30ml/kg腹腔注射麻醉動物，麻醉成功后將大鼠平臥固定在木板上，再分別用腹腔注射法接種1ml的ATCC25922標準大腸桿菌懸液（108CFU／ml），建立腹膜炎大鼠模型。

四、實驗方法將SD大鼠隨機分為六組，實驗組①15mmhg，60min，②5mmhg，60min，③15mmhg，180min，④5mmhg，180min，⑤對照60min組，⑥對照180min組。

對照組不經(jīng)過氣腹處理。

實驗組用空針針頭于大鼠下腹部穿刺，連接軟質(zhì)塑料管和Stryker氣腹機，按照不同要求設(shè)定壓力、流速檔位。

五、標本的采集按照設(shè)定的時間氣腹處理后，分別用實驗組和對照組的大鼠進行剖腹處理，在無菌條件下取腹水、門靜脈血液各自標號待檢，對其分別進行需氧和厭氧細菌的定量培養(yǎng)和菌種鑒定。

再對抽取的門靜脈血進行內(nèi)毒素測定。

六、觀測指標1腹水細菌CFU計數(shù)采取倍比稀釋平板菌落計數(shù)法，取各濃度100ul接種于麥康凱瓊脂平板上，分別做需氧和厭氧的細菌培養(yǎng)，厭氧細菌的培養(yǎng)是將培養(yǎng)基放入?yún)捬醮兄萌敕跸渑囵B(yǎng)，每個濃度做3個平板，對需氧和厭氧培養(yǎng)平板的細菌菌落進行計數(shù)。

計算公式細菌含量（cfu/ml）=（需氧+厭氧）菌落數(shù)*稀釋度/體積2血培養(yǎng)細菌陽性率處死動物后打開腹腔，取門靜脈血0.5ml,用一定量無菌生理鹽水稀釋，分別取100ul接種在血平板上進行需氧和厭氧培養(yǎng)，有肉眼可見細菌菌落生長則為陽性，如果平板培養(yǎng)3天以后仍沒有細菌生長，則為陰性。

3內(nèi)毒素的測定按照革蘭陰性菌脂多糖檢測試劑盒說明書進行操作，采用微生物快速動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)中進行檢測，反應(yīng)結(jié)束后自動計算出待測血漿中內(nèi)毒素含量。

七、統(tǒng)計分析計量資料都以均數(shù)標準差（MSD）表示，采用單因素方差分析和t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)都采用SPSS13.0軟件完成數(shù)據(jù)分析。

結(jié)果1腹水細菌CFU培養(yǎng)不同壓力及氣腹作用時間下對腹水進行細菌定量培養(yǎng)，其細菌濃度用CFU表示，如表1，表1不同壓力及氣腹作用時間下腹水細菌CFU計數(shù)(105cfu/ml)時間氣腹壓力60min180min高氣腹組15mmhg5.390.966.940.49低氣腹組5mmhg4.910.876.451.05對照組4.620.535.550.96氣腹3小時后各組之間的腹水細菌CFU/ml的含量有顯著性差異，P0.05，進一步進行兩兩比較，低氣腹組和高氣腹組細菌含量沒有差異，P0.05，而高氣腹組與對照組，低氣腹組與對照組相比有顯著性差異，P0.05。

對照組兩個時間點的腹水細菌濃度，按=0.05檢驗水準，P0.05，1h和3h兩個對照組之間有顯著性差異，說明大鼠誘發(fā)急性化學性腹膜炎后3h腹水細菌的濃度呈進行性增高。

說明在15mmhg和5mmhg二氧化碳氣腹處理3h后，細菌在腹腔的定植量有顯著增高，但氣腹壓力的增高并沒有使細菌的濃度有差異性的增高。

2血培養(yǎng)結(jié)果各組動物血培養(yǎng)結(jié)果見表2，各組都發(fā)生了細菌移位。

對照組中，1h和3h組之間的血培養(yǎng)陽性率無顯著性差異（P0.05），故認為各組時間的不同對血培養(yǎng)的陽性率的影響并無差異，所以將1h和3h組合并，分為高氣腹組、低氣腹組和對照組。

高氣腹組血培養(yǎng)陽性率高于對照組（P0.05），氣腹組血培養(yǎng)陽性率與對照組和高氣腹組相比差異沒有統(tǒng)計學意義（P0.05）。

表2不同壓力及時間血培養(yǎng)陽性結(jié)果（單位：

例數(shù)）時間氣腹壓力60min180min高氣腹組15mmhg56低氣腹組5mmhg34對照組123門靜脈內(nèi)毒素含量的結(jié)果不同壓力及氣腹作用時間下門靜脈內(nèi)毒素含量見表3，對照組各時點股靜脈血內(nèi)毒素含量的t檢驗結(jié)果P0.05，對照組各時點門靜脈血內(nèi)毒素含量有顯著性差異，其門靜脈血內(nèi)毒素含量隨著感染時間的增加呈進行性升高。

表3不同實驗組及對照組門靜脈內(nèi)毒素含量（pg/ml）時間氣腹壓力60min180min高氣腹組15mmhg73.655.6092.936.48低氣腹組5mmhg68.774.1388.134.55對照組64.404.8381.983.89氣腹1小時各組門靜脈血內(nèi)毒素含量的方差分析，按=0.05檢驗水準，可以認為三組大鼠股靜脈血的內(nèi)毒素含量有顯著性差別；進一步兩兩比較，可以認為高氣腹組和低氣腹組、高氣腹組和對照組之間門靜脈血內(nèi)毒素含量有差異，且高氣腹組內(nèi)毒素含量高于低氣腹組和對照組，而對照組與低氣腹組之間靜脈血內(nèi)毒素含量沒有差異（P0.05）。

氣腹3小時各組間門靜脈血內(nèi)毒素含量的方差分析與1小時類似，可以認為三組之間門靜脈血內(nèi)毒素含量都有差別（P0.05），且高氣腹組內(nèi)毒素含量高于低氣腹組，低氣腹組內(nèi)毒素含量高于對照組（P0.05）。

討論腸道是人體最大的細菌及內(nèi)毒素貯存庫，其中定植了很多致病菌與益生菌，但在正常情況下機體并沒有感染致病菌，這主要是依賴于完整的腸道粘膜屏障功能。

正常人體腸道粘膜屏障是由正常腸道菌群、免疫屏障和機械屏障構(gòu)成的，任一部分的異常都能造成腸道通透性的增加，繼而發(fā)生腸道細菌和內(nèi)毒素移位[5,6]。

二氧化碳氣腹造成腸道細菌移位及菌血癥的具體機制尚在研究中，一定壓力的氣腹可能造成了腸道機械屏障的破壞，從而促進了細菌的移位[7]。

完整的腸上皮粘膜細胞和緊密連接是構(gòu)成腸道機械屏障的重要組成部分[8]。

腸道局部的良好血液灌注及供氧是維持正常腸粘膜上皮細胞功能的重要因素。

Menconi等[9]研究發(fā)現(xiàn)酸中毒環(huán)境時，腸粘膜上皮細胞細胞膜結(jié)構(gòu)受損，細胞間緊密連接變得松散，細胞代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致細胞跨膜路徑和細胞通道同時增加，腸粘膜通透性增高，并且與酸中毒程度呈正相關(guān)。

程君濤等[10]指出腹內(nèi)壓增高可引起的小腸血流量顯著降低，黏膜上皮細胞發(fā)生急性缺血缺氧而導(dǎo)致其結(jié)果和功能的改變，損害的程度也與壓力的大小及作用時間有關(guān)。

而趙曉琴[11]等也證明了腹內(nèi)壓增高時，會造成小腸上皮細胞顯著損害和細胞間緊密連接(tightjunction)的疏松，導(dǎo)致腸粘膜通透性增高。

腸道的細菌和內(nèi)毒素更容易進入血液和淋巴，造成遠處器官細菌的播散。

大鼠腹膜炎本身就會導(dǎo)致腸道細菌的移位，這可能與炎癥反應(yīng)造成的腸粘膜屏障功能損害有關(guān)，且移位的細菌以厭氧菌為主[12]。

二氧化碳氣腹促進了腹膜炎大鼠的腸道內(nèi)毒素和細菌移位，并且隨壓力和時間的增加而升高。

即使在低壓氣腹狀態(tài)下，長時間的作用也能夠促進腹膜炎大鼠內(nèi)毒素的移位。

由于實驗大鼠最初通過腹腔注射大腸桿菌混懸液造成了急性細菌性腹膜炎，腹腔內(nèi)并無其它細菌感染，可知腹水培養(yǎng)出的細菌主要是由腸道細菌移位而來。

大腸桿菌和各種致病菌在合適的培養(yǎng)條件下，在對數(shù)期內(nèi)每隔20-30分鐘細菌數(shù)量就會成倍增長，直至養(yǎng)分的消耗及代謝廢物的增加數(shù)量達到穩(wěn)定[13]。

而當生長條件改變時，細菌的生長動力學也會受到影響[14]。

盡管CO2可以通過碳酸氫鹽的形式影響細菌細胞質(zhì)內(nèi)的PH值繼而抑制細菌的生長[15]，但一些實驗證明，二氧化碳本身可能也是一種細菌的生長抑制劑[16]。

但目前大部分的實驗都是在CO2高壓或者體外環(huán)境下實現(xiàn)的，而CO2在腹腔感染情況下對各種細菌生長繁殖和各種毒力的影響鮮有報道。

Sare等[17]在腹腔注射大腸桿菌致腹膜炎氣腹模型中觀察到，CO2氣腹組腹腔細菌計數(shù)對比開腹組和對照組有顯著升高，但他并沒有將需氧和厭氧細菌分開檢測。

Mustafasar等[18]在兔的腹膜炎模型中證明了，CO2氣腹組刺激了厭氧細菌的增殖和降低了機體清除細菌的能力，最終導(dǎo)致了腹腔膿腫的形成和腹膜炎的擴散，這可能是由于二氧化碳導(dǎo)致了缺氧環(huán)境引起的。

Matsumoto等[19]發(fā)現(xiàn)二氧化碳氣腹可能在抑制局部免疫應(yīng)答方面起重要作用，導(dǎo)致了機體清除細菌能力的降低。

但Armando等[20]卻觀察到二氧化碳氣腹并沒有改變腹膜清除細菌的能力，這需要更多的實驗研究去解釋產(chǎn)生這一矛盾結(jié)論的原因。

二氧化碳氣腹促進細菌的增殖及移位，和降低腹膜細菌清除能力這三者之間的相互關(guān)系還需要進一步探索。

我們的實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過二氧化碳氣腹處理3h后，細菌在腹腔的定植量有顯著增高，但氣腹壓力的增高并沒有使細菌的濃度有顯著性的增高。

結(jié)合之前氣腹促進了細菌和內(nèi)毒素移位的結(jié)論，我們推測即使CO2抑制了需氧細菌例如大腸桿菌、腸球菌等的增殖，但同時也促進了厭氧細菌例如類桿菌的增殖和降低了局部腹腔清除細菌的能力，使總的細菌CFU在氣腹處理后升高了，增加了敗血癥及全身感染擴散的風險。

所以，臨床上在進行腹腔鏡手術(shù)時，在有效暴露手術(shù)視野的前提下，應(yīng)該盡量減少氣腹持續(xù)時間和壓力，甚至選用無氣腹腹腔鏡手術(shù)，力求將二氧化碳氣腹對細菌性腹膜炎的不利影響降到最低，充分發(fā)揮腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù)的優(yōu)勢。

參考文獻[1]KosM;KueblerJF;Jesch,NK,etal.CarbondioxidedifferentiallyaffectsthecytokinereleaseofmacrophagesubpopulationsexclusivelyviaalterationofextracellularPH.[J]SurgEndosc2006，20(4)：

570-576[2]SuematsUT;HirabayashiY;ShiraishiNMorphologyofthemurineperitoneumafterpneumoperitoneumvsLaparotomy.[J]SurgEndosc2001,15(9):954958．[3]Chatzimavroudis,G.,etal.,CO2PneumoperitoneumProlongsSurvivalinanAnimalModelofPeritonitisComparedtoLaparotomy.JournalofSurgicalResearch,2009.152(1):69-75.[4]NavezB,TassettiV,ScohyJJ,MutterD,GuiotP.LaparoscopicManagementofacuteperitonitis.BrJSurg.1998;85:326[5]黎介壽加強對腸屏障功能障礙的研究．中華醫(yī)學雜志[J]1999，79：

581-582．[6]SteinbergSM．Bacterialtranslocation：

whatitisandwhatitisnot．AmSurg．[J]2003，186(3)：

301305.[7]Tu?T,OzbasS,TekeliA,etal.Doespneumoperitoneumcausebacterialtranslocation?JLaparoendoscAdvSurgTechA..1998,8(6):401-407.[8]李琴，劉立新,腸黏膜屏障與腸源性內(nèi)毒素血癥的關(guān)系研究進展.中華消化病與影像雜志(電子版),2012(04):291-294.[9]MenconiMJ,SalzmanAL,UnnoNetal.AcidosisinduceshyperpermeabilityinCaco-2BBeculturedintestinalepithelialmonolayers.AmJPhysiol.1997May;272(5Pt1):G1007-21.[10]程君濤，肖光夏，夏培元等.腹內(nèi)高壓致腸粘膜屏障損傷的實驗研究.中華燒傷雜志2006;22:33-37.[11]趙曉琴等,腹內(nèi)高壓對腸黏膜屏障功能損傷的影響.世界華人消化雜志,2013(34):3790-3798.[12]李錕，吳承堂，張軍花等嚴重腹腔感染早期腸黏膜病理損害的實驗觀察J南方醫(yī)科大學學報2006,26(2):202-204.[13]NotleyL,FrenciT.InductionofRpoS-dependentfunctionsinglucose-limitedcontinuousculture:whatlevelofnutrientlimitationinducesthestationaryphaseofEscherichiacoli?JBacteriol1996;178:1465e8.Piero-FernandezS,ChimerelC,KeyserUF,SummersDK.IndoletransportacrossEscherichiacolimembranes.JBacteriol2011;193:1793-1798.[14]MartnezH,BuhseT,RiveraM,etal.Effectofthevolume-to-surfaceratioofculturesonEscherichiacoligrowth:anexperimentalandtheoreticalanalysisCurrMicrobiol.2012Jul;65(1):60-65.[15]MerlinC,MastersM,McAteerS,CoulsonA.WhyiscarbonicanhydraseessentialtoEscherichiacoli?JBacteriol2003;185(21):6415-6424.[16]DixonNM,KellDB.TheinhibitionbyCO2ofthegrowthandmetabolismofmicro-organisms.JApplBacteriol1989;67(2):109-136.EklundT.Theeffectofcarbondioxideonbacterialgrowthandonuptakeprocessesinbacterialmembranevesicles.IntJFoodMicrobiol1984;1(4):179-185.[17]Sar