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文檔簡介

PAGEPAGE11維生素類藥物的分析維生素是維持人體正常生命活動所必需的一類活性物質(zhì),具有調(diào)節(jié)機體代謝過程和用于機體能量轉(zhuǎn)移等功能,體內(nèi)不能自行合成,須從食物中攝取。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看,維生素類均為有機化合物,但并不是同一類物質(zhì),而是分別屬于醇、酯、酸、胺、酚、醛等,其理化性質(zhì)和生理作用各異。一般可按其溶解度分為脂溶性和水溶性兩大類,脂溶性維生素有維生素A、D、E、K等,水溶性維生素有維生素B1、B2、B6、B12、C、煙酸、泛酸、葉酸等。根據(jù)本類藥物的生物特性及理化性質(zhì),其分析方法很多,有生物法、微生物法、化學(xué)法和物理化學(xué)法,其中常用的分析方法主要是化學(xué)法和物理化學(xué)法。本章僅對五類比較重要的維生素(A、B1、C、D、E)進行討論,闡述其化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及與分析方法的關(guān)系,結(jié)合《中國藥典》重點講解本類藥物的鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測定的原理和方法。維生素A的分析維生素A(VitaminA)包括維生素A1(視黃醇,Retinol)、去氫維生素A(Dehydroretinol,維生素A2)和去水維生素A(Anhydroretinol,維生素A3)等,其中維生素A1活性最高,維生素A2的生物活性是維生素A1的30%~40%,維生素A3的生物活性是維生素Al的0.4%。因此,通常所說的維生素A即指維生素A1。維生素A1是一種不飽和脂肪醇,目前主要采用人工合成方法制取。在自然界中,維生素A主要來源于鮫類無毒海魚肝臟中提取的脂肪油(通稱為魚肝油),其含量高達600000國際單位/克(IU/g)。在魚肝油中,維生素A多以各種酯類混合物的形式存在,其中主要是醋酸酯和棕櫚酸酯?!吨袊幍洹肥蛰d的維生素A是指人工合成的維生素A醋酸酯結(jié)晶加精制植物油制成的油溶液,同時還收載維生素A軟膠囊、維生素AD軟膠囊和維生素AD滴劑。藥物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)藥物結(jié)構(gòu)維生素A的結(jié)構(gòu)(圖4?1)為具有一個共軛多烯醇側(cè)鏈的環(huán)己烯,因而具有許多立體異構(gòu)體。天然維生素A主要是全反式維生素A。維生素A常以醋酸酯、棕櫚酸酯等形式存在,稱為酯式維生素A,而圖4?1則稱為醇式維生素A或維生素A醇。圖4?1維生素A去氫維生素A(圖4?2a)和去水維生素A(圖4?2b)以及無生物活性的維生素A醇的二聚體(鯨醇)也有紫外吸收,并能與顯色劑產(chǎn)生相近的顏色,在測定維生素A含量時必須考慮這些因素的干擾。(a)(b)圖4?2去氫維生素A(a)和去水維生素A(b)理化性質(zhì)溶解性維生素A與氯仿、乙醚、環(huán)己烷或石油醚能以任意比例混合,微溶于乙醇,不溶于水。穩(wěn)定性維生素A分子中含有多個不飽和鍵,性質(zhì)不穩(wěn)定,易被空氣中的氧或氧化劑氧化,也易被紫外光裂解,尤其是在加熱和金屬離子存在時更易氧化變質(zhì),生成無生物活性的環(huán)氧化合物,并能進一步氧化生成維生素A醛或維生素A酸。無空氣時,見光會聚合生成二聚體。長期放置,會發(fā)生異構(gòu)化。此外,維生素A對酸也不穩(wěn)定,遇酸可發(fā)生脫水反應(yīng)或發(fā)生異構(gòu)化。因此,維生素A及其制劑需密封避光保存,并加入合適的抗氧劑。維生素A醋酸酯或棕櫚酸酯較維生素A穩(wěn)定,故一般將酯式維生素A溶于植物油中供臨床使用。紫外吸收特性維生素A分子中具有共軛多烯醇的側(cè)鏈結(jié)構(gòu),在325~328nm波長范圍內(nèi)有最大吸收。顯色反應(yīng)維生素A在三氯甲烷中能與三氯化銻試劑作用,產(chǎn)生不穩(wěn)定的藍色。鑒別試驗維生素A與三氯化銻的顯色反應(yīng)(Carr-Price反應(yīng))可用于維生素A的鑒別。氯化銻(Ⅲ)中存在親電試劑氯化高銻(Ⅴ),維生素A的醇羥基可在其作用下裂解,形成不穩(wěn)定的藍色碳正離子。反應(yīng)方程式如下測定方法:取維生素A油溶液1滴,加氯仿10ml,振搖,使溶解;取2滴,加氯仿2ml和25%三氯化銻的氯仿溶液0.5ml,立即產(chǎn)生不穩(wěn)定的藍色,漸變成紫紅色。由于水可使三氯化銻水解成氯化氧銻(SbOCl),而乙醇可以和碳正離子作用使其正電荷消失,故反應(yīng)需在無水、無醇條件下進行。含量測定紫外?可見分光光度法原理與方法利用維生素A的紫外吸收特性,可測定維生素A的含量。目前,各國藥典均收載紫外?可見分光光度法作為維生素A法定的含量測定方法?!吨袊幍洹罚?010年版)規(guī)定,維生素A原料藥和維生素A軟膠囊均用本法測定含量。人工合成的維生素A或不同品種的魚肝油常含有多種異構(gòu)體、氧化降解產(chǎn)物、合成中間體、副產(chǎn)物等,維生素A制劑中還含有稀釋用油,這些物質(zhì)在325~328nm波長范圍內(nèi)也有吸收,故采用紫外?可見分光光度法測得的吸光度并不是維生素A獨有的吸收。為了消除非維生素A物質(zhì)的無關(guān)吸收所引起的誤差,須在規(guī)定條件下用校正公式進行校正,以求得準(zhǔn)確的結(jié)果。取供試品適量,精密稱定,溶于環(huán)己烷中,制成每1ml中含9~15IU的溶液,測定最大吸收波長(應(yīng)為328nm),并在300、316、328、340和360nm五個波長處分別測定吸光度,計算各波長處吸光度與328nm波長處吸光度的比值以及328nm波長處的。如果最大吸收波長在326~329nm之間,且各波長處測得的吸光度比值與表4?1中規(guī)定的值相比,差值均不超過±0.02,可不必校正,直接用328nm波長處的求得供試品中維生素A的含量,計算公式如下維生素A的含量(IU/g)=(328nm)×1900(4?AUTONUM)如果最大吸收波長在326~329nm之間,但各波長處測得的吸光度比值有任意一個或多個超過表4?1中規(guī)定的±0.02,則應(yīng)先按以下公式求得校正后的吸光度A校正A校正=3.52(2A328?A316?A340(4?AUTONUM)并計算A校正與A328的相對誤差(4?AUTONUM)若RE不超過±3.0%,則仍以未經(jīng)校正的吸光度A328計算含量;若RE在?15%至?3%之間,則以A校正計算含量;若RE小于?15%或大于+3%,則說明供試品中干擾測定的雜質(zhì)較多,須經(jīng)皂化法提取除去干擾后再進行測定。如果最大吸收波長不在326~329nm之間,也須將供試品經(jīng)皂化法提取后再進行測定。表4?1各波長處的吸光度比值λ/nm吸光度比值λ/nm吸光度比值3000.5553160.9073281.0003400.8113600.299凡須采用皂化法提取的供試品,應(yīng)另精密稱取一定量供試品(約相當(dāng)于維生素A總量500IU以上,質(zhì)量不多于2g),置于皂化瓶中,加乙醇30ml及50%氫氧化鉀溶液3ml,置水浴中煮沸回流30min,冷卻后,從冷凝管頂端加水10ml沖洗冷凝管內(nèi)壁,將皂化液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中(分液漏斗活塞涂以甘油淀粉潤滑劑),皂化瓶用水60~100ml分數(shù)次洗滌,洗液并入分液漏斗中,用不含過氧化物的乙醚振搖提取4次,每次振搖約5min,第一次60ml,以后各次40ml。合并乙醚液,用水洗滌數(shù)次,每次約100ml。洗滌時應(yīng)緩緩旋動,避免乳化,直至水層遇酚酞指示液不顯紅色。乙醚液用鋪有脫脂棉和無水硫酸鈉的濾器濾過,濾器用乙醚洗滌,洗液與乙醚液合并,置250ml容量瓶中,用乙醚稀釋至刻度,搖勻。精密量取該溶液適量,置于蒸發(fā)皿中,微溫揮去乙醚,迅速加入異丙醇溶解并定量稀釋,制成每1ml中含維生素A9~15IU,照紫外?可見分光光度法,在300、310、325和334nm四個波長處測定吸光度,并測定最大吸收波長(維生素A純品在異丙醇中的最大吸收波長為325nm)。最大吸收波長應(yīng)在323~327nm之間,且A300/A325應(yīng)不超過0.73。按以下公式求得校正后的吸光度A校正A校正=6.815A325?2.555A310?(4?AUTONUM)并計算A校正與A325的比值(4?AUTONUM)若R在97%~103%之間,則以未經(jīng)校正的吸光度A325計算含量;否則,以A校正計算含量。計算含量時,先用A325或A校正算出,再按以下公式計算維生素A的含量維生素A的含量(IU/g)=(325nm,校正)×1830(4?AUTONUM)如果最大吸收波長不在323~327nm之間,或A300/A325超過0.73,則應(yīng)從上述皂化后的乙醚提取液250ml中,另精密量取適量(相當(dāng)于維生素A300~400IU),微溫揮去乙醚至約剩5ml,再在氮氣流下吹干,立即精密加入甲醇3ml,溶解后,精密量取500μl,注入以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的液相色譜柱,以甲醇-乙腈-水(50:50:2)為流動相進行分離,檢測波長254nm,觀察色譜圖,要求維生素A與維生素D及其他物質(zhì)相互分離。準(zhǔn)確收集含有維生素A的流出液,在氮氣流下吹干,而后照上述方法自“迅速加入異丙醇溶解”起,依法操作并計算含量。討論校正公式采用的是三點法,即在供試品的吸收曲線上選取三個適當(dāng)?shù)牟ㄩLλ1(λmax)、λ2、λ3,分別測得吸光度,并根據(jù)校正公式計算最大吸收波長的吸光度校正值,進而計算維生素A含量的方法。該法以實驗結(jié)果為前提,假定在所選波長范圍內(nèi)(310nm~340nm)雜質(zhì)的吸收曲線幾乎呈一條直線,利用物質(zhì)對光的吸收具有加和性的原理而得出。式(4?2)采用直線方程式法(即代數(shù)法)推導(dǎo)而來,所選的三個波長有相等的波長間隔,即,稱為等波長差校正式(圖4?3a);式(4?4)采用相似三角形法(幾何法或稱6/7定位法)推導(dǎo)而來,所選的三個波長中,最大吸收波長兩側(cè)的吸光度相等,均為最大吸收波長處吸光度的6/7,稱為等吸收比校正式(圖4?3b)。①等波長差校正式的推導(dǎo):設(shè)波長λ1、λ2、λ3處維生素A純品的吸光度分別為、、;雜質(zhì)的吸光度分別為X1、X2、X3;維生素A供試品的吸光度分別為A1、A2、A3。(a)等波長差校正法(b)等吸收比校正法圖4?3維生素A含量測定的三點校正法圖解令根據(jù)吸光度的加和性,有(4?AUTONUM)故(4?AUTONUM)已知雜質(zhì)的吸收曲線為一直線,以f表示該直線的斜率,C表示該直線的截距,則有解此聯(lián)立方程式,得(4?AUTONUM)將式(4?9)代入式(4?8),整理得(4?AUTONUM)兩式相除,消去f,得(4?AUTONUM)解得(4?AUTONUM)由于,代入式(4?12),即可得到消除無關(guān)吸收后的吸光度校正值(4?AUTONUM)令,則,代入式(4?13),得(4?AUTONUM)利用維生素A純品在λ1、λ2、λ3三個波長處測得吸光度,可求得K1和K2,代入式(4?14),即得到等波長差校正式(4?2)。②等吸收比校正式的推導(dǎo):圖4?3b中曲線為維生素A純品的吸收曲線;曲線A2A1A3等吸收比校正法選擇最大吸收波長兩側(cè)的兩波長處吸光度相等,且均為最大吸收波長處吸光度的6/7,即(4?AUTONUM)設(shè)X=EM,Y=MH,根據(jù)吸光度的加和性,有(4?AUTONUM)(4?AUTONUM)將式(4?16)和式(4?17)代入式(4?15),得(4?AUTONUM)整理,得(4?AUTONUM)由圖4?3b可知,△FEM與△FDL為相似三角形,故(4?AUTONUM)則。又因為,故(4?AUTONUM)將式(4?21)代入式(4?19),得(4?AUTONUM)將式(4?21)和式(4?22)代入式(4?16),即可得到消除無關(guān)吸收后的吸光度校正值(4?AUTONUM)已知、、,故代入式(4?23),得(4?AUTONUM)在實際工作中,由式(4?24)求得的校正值比真實值高出2.6%~2.7%,故在上述各系數(shù)值中均減去2.65%,即得到等吸收比校正式(4?4)。采用三點校正法時,其中一點在最大吸收波長處測得,另外兩點分別在吸收曲線的上升和下降陡部的波長處測得,故儀器波長若不夠準(zhǔn)確,會產(chǎn)生較大誤差。因此,在測定之前,應(yīng)對儀器波長進行校正。維生素A易被紫外線及氧化性物質(zhì)破壞,因此測定應(yīng)在半暗室中盡快進行,且所用試藥應(yīng)不含有氧化性物質(zhì)。供試品直接用環(huán)己烷溶解后測定而不經(jīng)皂化提取,主要適用于純度較高的維生素A醋酸酯。0.344μg維生素A醋酸酯相當(dāng)于1IU,因此,與1g維生素A醋酸酯相當(dāng)?shù)膰H單位數(shù)為在環(huán)己烷中,維生素A醋酸酯的(328nm)為1530,故此時的換算因子(單位所相當(dāng)?shù)男r)為供試品采用皂化法提取后,以醇式維生素A存在。0.300μg維生素A醇相當(dāng)于1IU,因此,與1g維生素A醇相當(dāng)?shù)膰H單位數(shù)為皂化法處理后,以異丙醇為溶劑,此時維生素A醇的最大吸收波長為325nm,其(325nm)為1820,故換算因子為皂化法提取過程中,用水洗醚提取液時,第一次若強烈振搖,由于脂肪酸鹽與水產(chǎn)生部分游離脂肪酸,易導(dǎo)致乳化。為了防止乳化,應(yīng)小心緩緩旋動;也可以先用30ml氫氧化鉀激烈振蕩洗滌,再用水洗滌。若發(fā)生乳化,可加入數(shù)毫升異丙醇。高效液相色譜法作為集分離與分析于一體的測定方法,高效液相色譜法可用于干擾因素較多的情況下,更準(zhǔn)確地測定維生素A的含量?!吨袊幍洹罚?010年版)規(guī)定維生素AD軟膠囊和維生素AD滴劑中維生素A的含量測定采用高效液相色譜法。為了考察維生素A醋酸酯與其順式異構(gòu)體的分離度,需用碘試液對維生素A對照品進行破壞,以制備系統(tǒng)適用性試驗溶液。制備方法為:取維生素A對照品適量(約相當(dāng)于維生素A醋酸酯300mg),置燒杯中,加入碘試液0.2ml,混勻,放置約10min,定量轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,精密量取1ml,置100ml容量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻。如果維生素A對照品中含有順式異構(gòu)體,則可直接用于系統(tǒng)適用性分離度考察。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:用硅膠為填充劑,以正己烷-異丙醇(997:3)為流動相,檢測波長為325nm。取系統(tǒng)適用性試驗溶液10μl,注入液相色譜儀,維生素A醋酸酯主峰與其順式異構(gòu)體峰的分離度應(yīng)大于3.0。精密量取對照品溶液10μl,注入液相色譜儀,連續(xù)進樣5次,主成分峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不得過3.0%。測定方法:精密稱取供試品適量(約相當(dāng)于15mg維生素A醋酸酯),置100ml容量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,精密量取5ml,置50ml容量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液;另精密稱取維生素A對照品適量(約相當(dāng)于15mg維生素A醋酸酯),同法制成對照品溶液。精密量取供試品溶液和對照品溶液各10μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按外標(biāo)法以峰面積計算,含量應(yīng)符合規(guī)定。三氯化銻比色法三氯化銻比色法操作簡便、快速,但反應(yīng)專屬性差,且呈色不穩(wěn)定,已逐步被紫外?可見分光光度法或高效液相色譜法所替代,但在食品或飼料的維生素A含量測定中仍有應(yīng)用,以下僅作簡要介紹。維生素A與無水氯仿中的三氯化銻作用,產(chǎn)生一種不穩(wěn)定的藍色,在620nm波長處有最大吸收,符合Beer定律。因此,可取維生素A對照品,制成系列濃度的氯仿溶液,加入一定量三氯化銻的氯仿溶液,于620nm波長處測定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按同法測定供試品溶液的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。由于本法產(chǎn)生的藍色不穩(wěn)定,故操作必須迅速,加入三氯化銻的氯仿溶液后,應(yīng)在5~10s內(nèi)完成測定。反應(yīng)介質(zhì)必須無水,否則三氯化銻會水解產(chǎn)生SbOCl而使溶液混濁,影響比色。反應(yīng)的溫度對結(jié)果影響也很大,故要求樣品測定時的溫度與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時的溫度相差不得超過±1℃應(yīng)用本法測定維生素A含量時,還應(yīng)注意去水維生素A、胡蘿卜素等物質(zhì)也能在相同條件下與三氯化銻作用顯藍色,干擾測定,使測定結(jié)果偏高。此時,可采用氧化鋁柱分離凈化后,再進行測定。維生素B1的分析維生素B1(VitaminB1)在自然界廣泛存在于米糠、麥麩和酵母中,具有維持正常糖代謝及神經(jīng)傳導(dǎo)與消化的功能,主要用于治療維生素B1缺乏癥、多發(fā)性神經(jīng)炎和胃腸道疾病等?!吨袊幍洹肥蛰d有維生素B1及其片劑和注射劑。藥物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)藥物結(jié)構(gòu)維生素B1(圖4?4),也稱為鹽酸硫胺,化學(xué)名稱為氯化4-甲基-3[(2-甲基-4-氨基-5-嘧啶基)甲基]-5-(2-羥基乙基)噻唑鎓鹽酸鹽。它是由氨基嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)通過亞甲基連接而成的季銨類化合物。噻唑環(huán)上的季銨及嘧啶環(huán)上的氨基為兩個堿性基團,可與酸成鹽。圖4?4維生素B1理化性質(zhì)溶解性維生素B1是白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末,干燥品在空氣中可迅速吸收4%的水分。易溶于水,水溶液顯酸性;微溶于乙醇,不溶于乙醚。硫色素反應(yīng)維生素B1的噻唑環(huán)在堿性介質(zhì)中可開環(huán),再與嘧啶環(huán)上的氨基環(huán)合,經(jīng)鐵氰化鉀等氧化劑氧化生成硫色素,硫色素溶于正丁醇中顯藍色熒光。含氮雜環(huán)的沉淀反應(yīng)維生素B1分子中有嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)兩個含氮雜環(huán),可與碘化汞鉀、三硝基苯酚、碘溶液和硅鎢酸等生物堿沉淀試劑反應(yīng),生成組成恒定的沉淀。氯化物的特性維生素B1為鹽酸鹽,故本品的水溶液顯氯化物的鑒別反應(yīng)。紫外吸收特性維生素B1的芳雜環(huán)共軛體系具有紫外吸收,制成12.5μg/ml鹽酸溶液(9→1000),在246nm波長處測定吸光度,其吸收系數(shù)為406~436。鑒別試驗硫色素反應(yīng)硫色素反應(yīng)為維生素B1所特有的專屬性反應(yīng),可用于本品的鑒別。取本品約5mg,加氫氧化鈉試液2.5ml溶解后,加鐵氰化鉀試液0.5ml和正丁醇5ml,強力振搖2min,放置使分層,上層(醇層)顯強烈的藍色熒光;加酸使成酸性,熒光即消失;再加堿使成堿性,熒光又重現(xiàn)。紅外吸收光譜本品也可采用紅外吸收光譜法進行鑒別。取本品適量,加水溶解,水浴蒸干,在105℃氯化物反應(yīng)本品的水溶液顯氯化物的鑒別反應(yīng)。其他鑒別方法維生素B1與多種試劑反應(yīng)生成沉淀,亦可供鑒別。維生素B1與碘化汞鉀生成淡黃色沉淀。維生素B1與碘生成紅色沉淀。維生素B1與硅鎢酸生成白色沉淀。維生素B1與苦酮酸生成扇形白色結(jié)晶。維生素B1與NaOH共熱,分解產(chǎn)生硫化鈉,可與硝酸鉛反應(yīng)生成黑色沉淀。有關(guān)物質(zhì)的檢查維生素B1在生產(chǎn)和貯藏過程中較易降解,故《中國藥典》(2010年版)規(guī)定本品及其制劑均需采用高效液相色譜法檢查有關(guān)物質(zhì)。以維生素B1原料藥的有關(guān)物質(zhì)檢查方法為例。取本品,精密稱定,用流動相溶解并稀釋制成每1ml中約含1mg的溶液,作為供試品溶液;精密量取1ml,置100ml容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,以甲醇-乙腈-0.02mol/L庚烷磺酸鈉溶液(含1%三乙胺,用磷酸調(diào)至pH5.5)(9:9:82)為流動相,檢測波長為254nm,理論板數(shù)按維生素B1峰計算不低于2000,維生素B1峰與前后峰的分離度均應(yīng)符合要求。吸取對照溶液20μl,注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)檢測靈敏度,使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。再精密量取供試品溶液和對照溶液各20μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主峰保留時間的3倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰,各雜質(zhì)峰面積之和不得大于對照溶液主峰面積的0.5倍(0.5%)。含量測定維生素B1及其制劑常用的含量測定方法有非水溶液滴定法、紫外分光光度法和硫色素?zé)晒夥ā7撬芤旱味ǚㄔ砭S生素B1分子中含有兩個堿性的伯胺和季銨基團,在冰醋酸中,均可與高氯酸作用,故可用高氯酸滴定維生素B1。維生素B1與高氯酸反應(yīng)的摩爾比為1:2?!吨袊幍洹酚梅撬芤旱味ǚy定維生素B1原料藥。方法取本品約0.12g,精密稱定,加冰醋酸20ml,微熱使溶解,放冷,加醋酐30ml,用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定,以電位滴定法判斷滴定終點,并將滴定結(jié)果用空白試驗校正。每1ml高氯酸滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于16.86mg的C12H17ClN4OS?紫外?可見分光光度法維生素B1的紫外吸收特性可用于本品的含量測定?!吨袊幍洹穼⒆贤?可見分光光度法用于維生素B1片劑和注射劑的含量測定。維生素B1片的含量測定取本品20片,精密稱定,研細,精密稱取適量(約相當(dāng)于維生素B125mg),置100ml容量瓶中,加鹽酸(9→1000)約70ml,振搖15min,使維生素B1溶解,用鹽酸(9→1000)稀釋至刻度,搖勻,用干燥濾紙濾過,精密量取續(xù)濾液5ml,置另一100ml容量瓶中,再加鹽酸(9→1000)稀釋至刻度,搖勻,照紫外?可見分光光度法,在246nm波長處測定吸光度,按C12H17CIN4OS?HCl的吸收系數(shù)為421計算,即得。計算公式:(4?AUTONUM)式中,A為供試品在246nm波長處測得的吸光度;D為供試品的稀釋倍數(shù);為維生素B1片的平均片重;m為稱取維生素B1片粉的質(zhì)量。維生素B1注射液的含量測定精密量取本品適量(約相當(dāng)于維生素B150mg),置200ml容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,精密量取5ml,置100ml容量瓶中,用鹽酸(9→1000)稀釋至刻度,搖勻,照紫外?可見分光光度法,在246nm波長處測定吸光度,按C12H17ClN4OS?HCl的吸收系數(shù)為421計算,即得。計算公式:(4?AUTONUM)式中,A為供試品在246nm波長處測得的吸光度;D為供試品的稀釋倍數(shù);V為維生素B1注射液的取樣量。討論維生素B1的紫外吸收峰隨溶液pH的變化而變化,上述測定方法中,以0.1mol/LHCl溶液為溶劑,溶液的pH=2,最大吸收波長在246nm處,吸收系數(shù)為421。若采用磷酸鹽緩沖液使溶液的pH=7,則有兩個吸收峰,一個吸收峰在232~233nm波長處,吸收系數(shù)為345,另一個吸收峰在266nm波長處,吸收系數(shù)為255,此時,可采用差示分光光度法測定維生素B1的含量,能夠消除背景和輔料的干擾。硫色素?zé)晒夥ㄔ砭S生素B1在堿性溶液中被鐵氰化鉀氧化成硫色素,用異丁醇提取后,在紫外光照射下呈現(xiàn)藍色熒光,通過與對照品的熒光強度比較,即可測得供試品的含量。硫色素反應(yīng)是維生素B1的專屬性反應(yīng),雖非定量完成,但在一定條件下形成的硫色素與維生素B1濃度成正比,可用于維生素B1及其制劑的含量測定。由于反應(yīng)不受氧化破壞產(chǎn)物的干擾,故測定結(jié)果較準(zhǔn)確。缺點是操作繁瑣,且干擾熒光測定的因素較多?!睹绹幍洹凡捎帽痉y定維生素B1的含量。方法氧化試劑的制備:取新鮮配制的1.0%鐵氰化鉀溶液4.0ml,加3.5mol/L氫氧化鈉溶液制成100ml,于4h內(nèi)使用。對照品溶液的制備:精密稱取維生素B1對照品約25mg,溶于300ml的稀醇溶液(1→5),用3mol/LHCl溶液調(diào)節(jié)至pH4.0,加稀醇稀釋成1000ml,作為貯備液,避光冷藏,每月配制一次。取貯備液適量,用0.2mol/LHCl溶液逐步定量稀釋成0.2μg/ml的溶液。供試品溶液的制備:取供試品適量,用0.2mol/LHCl溶液溶解,制成100μg/ml的溶液(若供試品難溶,可在水浴上加熱使溶解),精密量取5ml,逐步定量稀釋成0.2μg/ml的溶液。測定方法:取40ml具塞試管3支或3支以上,各精密加入對照品溶液5ml,在1~2s內(nèi)向其中2支(或2支以上)試管中加入氧化試劑各3.0ml,再在30s內(nèi)加入異丁醇20.0ml,密塞,劇烈振搖90s;向另1支試管中加入3.5mol/L氫氧化鈉溶液3.0ml以替代氧化試劑,并照上述方法操作,作為空白。另取3支或3支以上的相同試管,各精密加入供試品溶液5ml,照上述對照品溶液的方法,同法處理。向上述6支或6支以上試管中,各加入無水乙醇2ml,旋搖數(shù)秒鐘,待分層后,取上層澄清的異丁醇液約10ml,置熒光計測定池內(nèi),測定其熒光強度(λex=365nrn,λem=435nm)。計算公式:5ml供試品溶液中維生素B1的質(zhì)量(μg)=(4?AUTONUM)式中,A和S分別為供試品溶液和對照品溶液測得的平均熒光讀數(shù);b和d分別為其相應(yīng)的空白讀數(shù);0.2為對照品溶液的質(zhì)量濃度(μg/ml);5為測定時對照品溶液的取樣體積(ml)。維生素C的分析維生素C(VitaminC)在化學(xué)結(jié)構(gòu)上和糖類十分相似,有4種光學(xué)異構(gòu)體,其中以L-構(gòu)型右旋體的生物活性最強,故各國藥典收載的維生素C均為該構(gòu)型,又稱為L-抗壞血酸(L-ascorbicacid)?!吨袊幍洹罚?010年版)收載有維生素C原料及其片劑、顆粒劑、注射劑及泡騰片和泡騰顆粒。藥物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)藥物結(jié)構(gòu)維生素C(圖4?5)分子結(jié)構(gòu)中具有烯二醇結(jié)構(gòu)和內(nèi)酯環(huán),并有2個手性碳原子,因此,維生素C性質(zhì)非?;顫?,且具有旋光性。圖4?5維生素C理化性質(zhì)溶解性維生素C易溶于水,水溶液呈酸性;微溶于乙醇,不溶于氯仿和乙醚。還原性維生素C分子中的烯二醇基具有極強的還原性,易被氧化為二酮基而成為去氫抗壞血酸,去氫抗壞血酸仍具有生物活性,且加氫又可還原為抗壞血酸。在堿性溶液或強酸性溶液中,去氫抗壞血酸進一步水解為不具有活性的二酮古洛糖酸,此反應(yīng)為不可逆反應(yīng)。酸性維生素C分子中的烯二醇基,特別是C3—OH因受共軛效應(yīng)的影響,酸性較強(pKa1=4.17);C2—OH的酸性極弱(pKa2=11.57)。因此,維生素C一般表現(xiàn)為一元酸,可與碳酸氫鈉作用生成鈉鹽。旋光性維生素C分子中有2個手性碳原子,故有4個光學(xué)異構(gòu)體,其中L(+)—抗壞血酸活性最強。維生素C的比旋度為+20.5°至+21.5°。水解性維生素C與碳酸鈉作用生成單鈉鹽,此時,雙鍵的存在使內(nèi)酯環(huán)變得較穩(wěn)定,不會發(fā)生水解;但在強堿性溶液中,內(nèi)酯環(huán)可發(fā)生水解,生成酮酸鹽。糖類物質(zhì)的性質(zhì)維生素C的化學(xué)結(jié)構(gòu)與糖類物質(zhì)相似,具有糖類物質(zhì)的性質(zhì)和反應(yīng)。紫外吸收特性維生素C具有共軛雙鍵,其稀鹽酸溶液在243nm波長處有最大吸收,為560;在中性或堿性條件下,最大吸收波長紅移至265nm處。鑒別試驗與硝酸銀反應(yīng)可利用維生素C的強還原性對其進行鑒別,例如,維生素C可被硝酸銀氧化為去氫抗壞血酸,同時硝酸銀被還原生成黑色金屬銀沉淀。反應(yīng)方程式如下鑒別方法:取本品0.2g,加水10ml溶解。取該溶液5ml,加入硝酸銀試液0.5ml,即生成銀的黑色沉淀。與2,6-二氯靛酚反應(yīng)維生素C可將有機染料2,6-二氯靛酚還原為無色。2,6-二氯靛酚在酸性介質(zhì)中為玫瑰紅色,堿性介質(zhì)中為藍色,與維生素C作用后生成無色的酚亞胺。反應(yīng)方程式如下鑒別方法:取本品0.2g,加水10ml溶解。取該溶液5ml,加二氯靛酚鈉試液1~2滴,試液的顏色即消失。與其他氧化劑的反應(yīng)維生素C還可還原亞甲藍、高錳酸鉀、堿性酒石酸銅試液、磷鉬酸等氧化劑,使其試劑褪色、產(chǎn)生沉淀或呈現(xiàn)顏色,也可用于鑒別。紅外吸收光譜和紫外特征吸收《中國藥典》將紅外吸收光譜法用于本品的鑒別,《英國藥典》則利用本品在0.01mol/LHCl溶液中,于243nm波長處有唯一最大吸收的特征進行鑒別,規(guī)定其吸收系數(shù)應(yīng)為545~585。利用糖類物質(zhì)的性質(zhì)維生素C具有糖類物質(zhì)的性質(zhì)和反應(yīng),可在三氯化醋酸或鹽酸存在下水解、脫羧、生成戊糖,再失水,轉(zhuǎn)化為糠醛,加入吡咯并加熱至50℃可雜質(zhì)檢查溶液澄清度與顏色的檢查維生素C的水溶液在高于或低于pH5~6時,受空氣、光線和溫度的影響,分子中的內(nèi)酯環(huán)可發(fā)生水解,并進一步發(fā)生脫羧反應(yīng)生成糠醛聚合呈色。因此,維生素C及其制劑在貯存期間易變色,且顏色隨貯存時間的延長而逐漸加深。為了保證產(chǎn)品質(zhì)量,《中國藥典》規(guī)定維生素C及其片劑、注射劑應(yīng)檢查溶液的澄清度與顏色,以控制有色雜質(zhì)的量??刹捎每刂莆舛鹊姆椒ㄟM行檢查。由于維生素C制劑在加工過程中不可避免會使有色雜質(zhì)增加,故其限量比原料藥略寬。此外,片劑和注射劑中所含有色雜質(zhì)的吸收峰略有不同,故測定限量時所用波長也不同。維生素C原料藥的溶液澄清度與顏色檢查取供試品3.0g,加水15ml,振搖使溶解,溶液應(yīng)澄清無色;如顯色,將溶液經(jīng)4號垂熔玻璃漏斗濾過,取濾液,照紫外?可見分光光度法,在420nm波長處測定吸光度,不得過0.03。維生素C片的溶液顏色檢查取本品細粉適量(相當(dāng)于維生素C1.0g),加水20ml,振搖使維生素C溶解,濾過,濾液照紫外?可見分光光度法,在440nm波長處測定吸光度,不得過0.07。維生素C注射液的顏色檢查取本品適量,加水稀釋,制成每1ml中含維生素C50mg的溶液,照紫外?可見分光光度法,在420nm波長處測定吸光度,不得過0.06。鐵、銅離子的檢查鐵離子的檢查取本品5.0g兩份,分別置25ml容量瓶中,一份中加0.1mol/L硝酸溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(B);另一份中加標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液(精密稱取硫酸鐵銨863mg,置1000ml容量瓶中,加1mol/LH2SO4溶液25ml,加水稀釋至刻度,搖勻,精密量取10ml,置100ml容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻)1.0ml,加0.1mol/L硝酸溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液(A)。照原子吸收分光光度法,在248.3nm波長處分別測定,應(yīng)符合規(guī)定,即若A和B溶液測得的吸光度分別為Aa和Ab,則要求Ab<(Aa-Ab)。銅離子的檢查取本品2.0g兩份,分別置25ml容量瓶中,一份中加0.1mol/L硝酸溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(B);另一份中加標(biāo)準(zhǔn)銅溶液(精密稱取硫酸銅393mg,置1000ml容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取10ml,置100ml容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻)1.0ml,加0.1mol/L硝酸溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液(A)。照原子吸收分光光度法,在324.8nm波長處分別測定,應(yīng)符合規(guī)定,即若A和B溶液測得的吸光度分別為Aa和Ab,則要求Ab<(Aa-Ab)。含量測定維生素C的含量測定大多利用其還原性。其中,容量分析法簡便快速、結(jié)果準(zhǔn)確,被廣泛采用,如碘量法,2,6-二氯靛酚滴定法等?!吨袊幍洹凡捎昧说饬糠ㄗ鳛楸酒返暮繙y定方法。原理維生素C在醋酸酸性條件下,可被碘定量氧化。根據(jù)消耗碘滴定液的體積,即可計算維生素C的含量。方法取本品約0.2g,精密稱定,加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解,加淀粉指示液1ml,立即用碘滴定液(0.05mol/L)滴定,至溶液顯藍色并在30s內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6。注意事項在酸性介質(zhì)中,維生素C受空氣中氧的氧化速度減慢,故應(yīng)加入稀醋酸10ml使滴定在酸性溶液中進行,且樣品溶于稀醋酸后需立即進行滴定。加新沸過的冷水可減少水中溶解的氧,從而避免維生素C被其氧化。本法不僅可用于維生素C原料藥的含量測定,也可用于其制劑的含量測定。但用于制劑的含量測定時,應(yīng)注意消除輔料對測定的干擾,滴定前需進行必要的處理。如片劑溶解后應(yīng)濾過,取續(xù)濾液測定;注射劑測定前需加丙酮2ml,以消除注射劑中抗氧劑亞硫酸氫鈉對測定的影響。維生素D的分析維生素D(VitaminD)是一類抗佝僂病維生素的總稱。目前已知的維生素D類物質(zhì)有10多種,均為甾醇的衍生物?!吨袊幍洹分饕蛰d有維生素D2、D3原料藥,維生素D2軟膠囊、注射液及維生素D3注射液;此外,維生素AD軟膠囊和維生素AD滴劑中的維生素D亦為維生素D2或維生素D3。藥物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)藥物結(jié)構(gòu)維生素D2(圖4?6a),又名骨化醇(Calciferol)或麥角骨化醇(Ergocalciferol),化學(xué)名稱為9,10-開環(huán)麥角甾-5,7,10(19,22)-四烯-3β-醇。維生素D3(圖4?6b),又名膽骨化醇(Colecalciferol),化學(xué)名稱為9,10-開環(huán)膽甾-5,7,10(19)-三烯-3β-醇。兩者的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分相似,其差別僅在于維生素D2比維生素D3在側(cè)鏈上多一個雙鍵和一個甲基(a)(b)圖4?6維生素D2(a)和維生素D3(b)理化性質(zhì)溶解性維生素D2、D3均為無色針狀結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末。維生素D2極易溶于氯仿,易溶于乙醇、丙酮和乙醚;維生素D3則在氯仿、乙醇、丙酮和乙醚中均極易溶解;二者均微溶于植物油,不溶于水。穩(wěn)定性維生素D2、D3均含有多個烯鍵,性質(zhì)極不穩(wěn)定,遇光或空氣及其他氧化劑均可發(fā)生氧化而變質(zhì),導(dǎo)致效價降低、毒性增強。此外,二者對酸也不穩(wěn)定。旋光性維生素D2、D3分別具有6個和5個手性碳原子,故二者均具有旋光性,維生素D2比旋度為+102.5°至+107.5°,維生素D3比旋度為+105°至+112°。顯色反應(yīng)維生素D屬甾類化合物,具有甾類化合物共有的顯色反應(yīng):其氯仿溶液加醋酐與硫酸,初顯黃色,漸變紅色,隨即變?yōu)樽仙?,最后變?yōu)榫G色。紫外吸收特性本品以無水乙醇溶解并定量稀釋制成每1ml中約含10μg的溶液。照紫外?可見分光光度法,在265nm波長處測定吸光度,維生素D2的吸收系數(shù)為460~490,維生素D3的吸收系數(shù)為465~495。鑒別試驗顯色反應(yīng)與醋酐-濃硫酸反應(yīng)取維生素D2或D3約0.5mg,加氯仿5ml溶解,再加醋酐0.3ml和硫酸0.1ml,振搖。維生素D2初顯黃色,漸變紅色,隨即變?yōu)樽仙?,最后變成綠色;維生素D3初顯黃色,漸變紅色,隨即變?yōu)樽仙?、藍綠色,最后變成綠色?!吨袊幍洹凡捎帽痉ㄟM行鑒別。其他顯色反應(yīng)維生素D以1,2-二氯乙烷溶解后,可與三氯化銻反應(yīng),顯橙紅色,然后逐漸變?yōu)榉奂t色。維生素D還可與三氯化鐵反應(yīng)顯橙黃色,或與二氯丙酮和乙酰氯試劑反應(yīng)顯綠色,亦可用于鑒別,但專屬性不強。用于區(qū)分維生素D2與D3的顯色反應(yīng)取維生素D10mg,加入96%乙醇10ml使溶解。吸取該溶液0.1ml,加入乙醇1ml和85%硫酸5ml。維生素D2顯紅色,在570nm波長處有最大吸收;維生素D3顯黃色,在495nm波長處有最大吸收。紅外吸收光譜《中國藥典》亦采用紅外吸收光譜法鑒別本品。高效液相色譜法《中國藥典》(2010年版)將本法用于維生素D的鑒別,規(guī)定在含量測定項下記錄的色譜圖中,供試品溶液主峰的保留時間應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間一致。其他鑒別方法可利用維生素D的旋光性鑒別本品,以無水乙醇為溶劑,維生素D2制成40mg/ml的溶液,維生素D3制成5mg/ml的溶液,測定比旋度,應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)。此外,亦可用制備衍生物測熔點、紫外特征吸收等方法鑒別本品。雜質(zhì)檢查麥角甾醇的檢查《中國藥典》規(guī)定維生素D2應(yīng)檢查麥角甾醇,而維生素D3則無此要求。維生素D2中麥角甾醇的檢查方法:取本品10mg,加90%乙醇2ml溶解,再加洋地黃皂苷溶液(取洋地黃皂苷20mg,加90%乙醇2ml,加熱溶解制成)2ml,混合,放置18h,不得發(fā)生渾濁或沉淀。有關(guān)物質(zhì)維生素D2、D3分別從各自5,7-二烯甾醇前體7-脫氫膽甾醇和麥角甾醇的光照而得。前維生素D的光照產(chǎn)物除了維生素D之外,尚有前維生薉D、光甾醇、速甾醇、5,6-反式維生素D等。同時,維生素D性質(zhì)也不穩(wěn)定,光、空氣、氧化劑、酸等均能使其變質(zhì),以致效價降低、毒性增強。為此,《中國藥典》(2010年版)要求本品應(yīng)檢查有關(guān)物質(zhì)。檢查方法:取本品約25mg,置100ml棕色容量瓶中,加異辛烷80ml,避免加熱,超聲處理1min使完全溶解,放冷,用異辛烷稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液;精密量取1ml,置100ml棕色容量瓶中,用異辛烷稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液。用硅膠為填充劑;以正己烷-正戊醇(997∶3)為流動相;檢測波長為254nm,取對照溶液100μl注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)檢測靈敏度,使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%,再精密量取供試品溶液與對照溶液各100μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖至維生素D2或D3峰保留時間的2倍。供試品溶液的色譜圖中如有雜質(zhì)峰,除前維生素D2或D3峰外,單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.5倍(0.5%),各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積(1.0%)。含量測定《中國藥典》采用正相高效液相色譜法測定維生素D(包括維生素D2和D3,下同)的含量,可用于維生素D及其制劑、維生素AD軟膠囊和滴劑或魚肝油中所含維生素D及前維生素D經(jīng)折算成維生素D的總量的測定。結(jié)果以IU表示,每1IU相當(dāng)于維生素D0.025μg。維生素D含量測定分第一法、第二法和第三法。無維生素A醇及其他雜質(zhì)干擾的供試品可用第一法測定,否則應(yīng)按第二法處理后測定;如果按第二法處理后,前維生素D峰仍受雜質(zhì)干擾,僅有維生素D峰可以分離時,則應(yīng)按第三法測定。例如,維生素D原料藥及制劑均可按第一法測定,而維生素AD制劑或魚肝油中所含維生素D則須視情況選擇第二法或第三法測定。第一法對照品貯備溶液的制備根據(jù)各制劑中所含維生素D的成分,精密稱取相應(yīng)的維生素D2或D3對照品25mg,置100ml棕色容量瓶中,加異辛烷80ml,避免加熱,超聲處理1min使完全溶解,用異辛烷稀釋至刻度,搖勻,作為貯備溶液(1);精密量取5ml,置50ml棕色容量瓶中,用異辛烷稀釋至刻度,搖勻,充氮密塞,避光,0℃以下保存,作為貯備溶液(2)測定維生素D2時,應(yīng)另取維生素D3對照品25mg,同法制成維生素D3對照品貯備溶液,供系統(tǒng)適用性試驗用。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用硅膠為填充劑;以正己烷-正戊醇(997∶3)為流動相;檢測波長為254nm。量取維生素D3對照品貯備溶液(1)5ml,置具塞玻璃容器中,通氮后密塞,置90℃水浴中加熱1h,取出,迅速冷卻,加正己烷5ml,搖勻,置1cm具塞石英吸收池中,在2支8W主波長分別為254nm和365nm的紫外光燈下,將石英吸收池斜放成45°,并距燈管5~6cm,照射5min,使溶液中含有前維生素D3、反式維生素D3、維生素D3和速甾醇D3;量取該溶液注入液相色譜儀,進樣5次,記錄峰面積,維生素D3峰的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%;前維生素D3峰(與維生素D3相對保留時間約為0.5)與反式維生素D3峰(與維生素D3相對保留時間約為0.6)以及維生素D3峰與速甾醇D3峰(與維生素D3相對保留時間約為1.1)的分離度均應(yīng)大于響應(yīng)因子測定精密量取對照品貯備溶液(2)5ml,置50ml容量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液;取10μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,計算維生素D的響應(yīng)因子f1。(4?AUTONUM)式中,c1為維生素D對照品溶液的濃度(μg/ml),A1為對照品溶液色譜圖中維生素D峰的峰面積。另精密量取對照品貯備溶液(1)5ml,置50ml容量瓶中,加2,6-二叔丁基對甲酚結(jié)晶1粒,通氮排除空氣后,密塞,置90℃水浴中加熱1.5h,取出,迅速冷卻,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,作為混合對照品溶液;取10μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,計算前維生素D的響應(yīng)因子f2(4?AUTONUM)式中,A2為混合對照品溶液色譜圖中前維生素D峰的峰面積。測定法取該制劑項下制備的供試品溶液進行測定,按下列公式計算維生素D及前維生素D折算成維生素D的總量(ci)。(4?AUTONUM)式中,Ai1為維生素D峰的峰面積,Ai2為前維生素D峰的峰面積。第二法供試品溶液A的制備(皂化提?。┚芊Q取供試品適量(相當(dāng)于維生素D總量600IU以上,質(zhì)量不超過2.0g),置皂化瓶中,加乙醇30ml、維生素C0.2g與50%氫氧化鉀溶液3ml(若供試量為3g,則加50%氫氧化鉀溶液4ml),置水浴上加熱回流30min,冷卻后,自冷凝管頂端加水10m1沖洗冷凝管內(nèi)壁,將皂化液移至分液漏斗中,皂化瓶用水60~100ml分數(shù)次洗滌,洗液并入分液漏斗中,用不含過氧化物的乙醚振搖提取3次,第一次60ml,以后每次40ml,合并乙醚液,用水洗滌數(shù)次,每次約100ml,洗滌時應(yīng)緩緩旋動,避免乳化,直至水層遇酚酞指示液不再顯紅色,靜置,分取乙醚提取液,加入干燥濾紙條少許振搖除去乙醚提取液中殘留的水分,分液漏斗及濾紙條再用少量乙醚洗滌,洗液與提取液合并,置具塞圓底燒瓶中,在水浴上低溫蒸發(fā)至約5ml,再用氮氣流吹干,迅速精密加入甲醇3ml供試品溶液B的制備(凈化用色譜柱系統(tǒng)分離收集維生素D)精密量取上述供試品溶液A500μl,注入以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的液相色譜柱,以甲醇-乙腈-水(50∶50∶2)為流動相進行分離,檢測波長為254nm,記錄色譜圖,維生素D與前維生素D應(yīng)為重疊峰,并能與維生素A及其他雜質(zhì)分開。準(zhǔn)確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液,置具塞圓底燒瓶中,用氮氣流迅速吹干,精密加入正己烷適量,使每1ml中含維生素D50~140IU,密塞,超聲處理使溶解,即得供試品溶液B。測定法取供試品溶液B,照第一法進行含量測定,進樣量為100~200μl。第三法供試品溶液的制備取該制劑項下制備的供試品溶液A,按上述第二法“供試品溶液B的制備”項下的方法處理,至“用氮氣流迅速吹干”后,加入異辛烷2ml溶解,通氮排除空氣后,密塞,置90℃水浴中,加熱1.5h后,立即通氮在2min內(nèi)吹干,迅速精密加入正己烷2ml,溶解后,即得對照品溶液的制備精密量取對照品貯備溶液(1)適量,加異辛烷定量稀釋制成每1m1中約含維生素D50IU,精密量取2ml,置具塞圓底燒瓶中,照供試品溶液制備項下的方法,自“通氮排除空氣后”起,依法操作,得對照品溶液。測定法照第一法項下的色譜條件,精密量取對照品溶液與供試品溶液C各200μ1,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按外標(biāo)法以峰面積計算維生素D的含量。注意事項維生素D易受光照、氧化而發(fā)生變化,故測定應(yīng)在半暗室中及避免氧化的情況下進行,必要時可通惰性氣體和使用棕色玻璃容器。皂化提取過程中,振搖不劇烈及水浴溫度大于40℃均導(dǎo)致維生素E的分析維生素E(VitaminE)為α-生育酚(α-Tocopherol)及其各種酯類,有天然品和合成品之分。天然品為右旋體(d-α),合成品則為消旋體(dl-α),右旋體與消旋體的效價比為1.4∶10?!吨袊幍洹肥蛰d的維生素E是合成型或天然型維生素E,同時收載有維生素E片劑、軟膠囊、粉劑和注射劑。藥物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)藥物結(jié)構(gòu)維生素E(圖4?7)為苯并二氫吡喃醇衍生物,苯環(huán)上有一個乙?;姆恿u基,故又稱為生育酚,有α、β、γ和δ等多種異構(gòu)體,其中以α-異構(gòu)體的生理活性最強。一般常用α-生育酚醋酸酯,性質(zhì)比α-生育酚穩(wěn)定。合成型維生素E的化學(xué)名稱為(±)-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基十三烷基)-6-苯并二氫吡喃醇醋酸酯或dl-α-生育酚醋酸酯;天然型維生素E的化學(xué)名稱為(+)-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基十三烷基)-6-苯并二氫吡喃醇醋酸酯或dl-α-生育酚醋酸酯。(a)天然型(b)合成型圖4?7維生素E理化性質(zhì)溶解性維生素E為微黃色或黃色透明的粘稠液體,易溶于無水乙醇、丙酮、乙醚和石油醚,不溶于水。穩(wěn)定性維生素E在無氧條件下對熱穩(wěn)定,加熱至200℃也不會被破壞,但對氧十分敏感,遇光、空氣可被氧化,其氧化產(chǎn)物為α-生育醌和α維生素E在酸性或堿性溶液中加熱可水解生成游離的生育酚,游離生育酚在有氧或其他氧化劑存在時,還可進一步氧化生成有色的醌型化合物,尤其在堿性條件下,氧化反應(yīng)更易發(fā)生。所以,游離生育酚暴露于空氣和日光中極易被氧化而變色,應(yīng)避光保存。紫外吸收特性本品具有紫外吸收,以無水乙醇為溶劑,在284nm波長處有最大吸收,其吸收系數(shù)為41.0~45.0。鑒別試驗與硝酸反應(yīng)維生素E在硝酸酸性條件下,水解生成游離生育酚,生育酚被硝酸氧化為鄰醌結(jié)構(gòu)的生育紅而顯橙紅色。取本品約30mg,加無水乙醇10ml溶解,再加硝酸2ml,搖勻,在75℃加熱約15min,溶液應(yīng)顯橙紅色。本法簡便、快捷、呈色明顯。紅外吸收光譜《中國藥典》采用紅外吸收光譜法鑒別維生素E原料藥,要求本品的紅外光吸收圖譜與對照的圖譜一致。氣相色譜法《中國藥典》(2010年版)將氣相色譜法用于維生素E及其制劑的鑒別,按含量測定項下的方法試驗,供試品主峰的保留時間應(yīng)與維生素E對照品峰的保留時間一致。其他方法與三氯化鐵反應(yīng)維生素E在堿性條件下,水解生成游離生育酚,生育酚經(jīng)乙醚提取后,可被FeCl3氧化生成對-生育酚,同時Fe3+被還原為Fe2+,F(xiàn)e2+與聯(lián)吡啶反應(yīng)生成紅色的配位離子。本法曾有較廣泛的應(yīng)用,但因其操作麻煩,專屬性也不高,現(xiàn)已被氣相色譜法所取代。紫外?可見分光光度法本品的0.01%無

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