大學(xué)生物化學(xué)第10章 復(fù)制課件

DNA的生物合成(復(fù)制)DNABiosynthesis，Replication

第十章大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制復(fù)制（replication）是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復(fù)制親代DNA子代DNA大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制復(fù)制的基本規(guī)律BasicRulesofDNAReplication

第一節(jié)大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制復(fù)制的方式——半保留復(fù)制（semi-conservativereplication）復(fù)制的高保真性（highfidelity）雙向復(fù)制（bidirectionalreplication）半不連續(xù)復(fù)制（semi-discontinuousreplication）大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制一、半保留復(fù)制的實驗依據(jù)和意義DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板（template）按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的概念大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA

目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式

全保留式半保留式混合式大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制密度梯度實驗

——實驗結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-DNA的細菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制原核生物復(fù)制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。二、雙向復(fù)制復(fù)制中的放射自顯影圖象大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點B.復(fù)制中的兩個復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(termination,ter)oriterABC大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復(fù)制子(replicon)。復(fù)制子是獨立完成復(fù)制的功能單位。大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制子3’大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制三、復(fù)制的半不連續(xù)性3

5

3

5

解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈（laggingstrand）大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段（okazakifragment）。

領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制

DNA復(fù)制的酶學(xué)TheEnzymologyofDNAReplication第二節(jié)大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制參與DNA復(fù)制的物質(zhì)底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質(zhì)因子大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制聚合反應(yīng)的特點DNA新鏈生成需引物和模板；新鏈的延長只可沿5→3

方向進行。大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制二、DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase）簡稱：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合活性2.核酸外切酶活性大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′3

5

外切酶活性5

3

外切酶活性?能切除突變的DNA片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。

核酸外切酶活性目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制（一）原核生物的DNA聚合酶大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制功能：對復(fù)制中的錯誤進行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進行填補。DNA-polⅠ（109kD）大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制323個氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因發(fā)生突變，細菌依然能存活。它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制功能是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制（二）真核生物的DNA聚合酶大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制三、復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能準確傳代的基本原理。復(fù)制保真性的酶學(xué)機制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀

（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇?DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價（氫鍵）與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。?嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制1.遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；2.聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能；3.復(fù)制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機制

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制四、復(fù)制中的分子解鏈及DNA分子拓撲學(xué)變化

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制E.Coli基因圖目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase)——復(fù)制起始時催化生成RNA引物的酶單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制108

局部解鏈后（二）DNA拓撲異構(gòu)酶(DNAtopoisomerase)

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制解鏈過程中正超螺旋的形成目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制拓撲異構(gòu)酶作用特點既能水解、又能連接磷酸二酯鍵

拓撲異構(gòu)酶Ⅰ

拓撲異構(gòu)酶Ⅱ分類大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制拓撲異構(gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓撲異構(gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。作用機制

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制五、DNA連接酶連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰DNA鏈5

-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制DNA生物合成過程TheProcessofDNAReplication第三節(jié)大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制（一）復(fù)制的起始需要解決兩個問題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制E.coli復(fù)制起始點oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復(fù)序列

反向重復(fù)序列5

3

5

3

1.DNA解鏈大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制DnaADnaB、DnaCDNA拓撲異構(gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

2.引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制（二）復(fù)制的延長復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制領(lǐng)頭鏈的合成目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制隨從鏈的合成目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制階段一階段二大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制階段三階段四大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制復(fù)制過程簡圖目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制復(fù)制過程動畫大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）復(fù)制的終止大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制哺乳動物的細胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成

?細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關(guān)鍵點。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。?蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實施調(diào)控作用。大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制?真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動。?復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復(fù)制因子(replicationfactor,RF)。?增殖細胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。（一）復(fù)制的起始大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制3

5

5

3

領(lǐng)頭鏈3

5

3

5

親代DNA隨從鏈引物核小體（二）復(fù)制的延長大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）復(fù)制的終止大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制切除引物的兩種機制目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。功能?維持染色體的穩(wěn)定性?維持DNA復(fù)制的完整性結(jié)構(gòu)特點?由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。?末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制端粒酶的催化延長作用爬行模型目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制DNA聚合酶復(fù)制子鏈進一步加工目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第四節(jié)大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)RNADNA

逆轉(zhuǎn)錄酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈。試管內(nèi)合成cDNAcDNAcomplementaryDNA大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義

逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論。

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制

滾環(huán)復(fù)制(rollingcirclereplication)三、滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制

是某些低等生物的復(fù)制形式，如

X174和M13噬菌體等。大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制3

-OH5

-P5

5

5

3

3

3

3

5'滾環(huán)復(fù)制5'

5

3

3

5

目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制dNTPDNA-polγ

D環(huán)復(fù)制(D-loopreplication)

是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復(fù)制形式。

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制DNA損傷（突變）與修復(fù)DNADamage(Mutation)andRepair第五節(jié)大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變。在復(fù)制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNAdamage)。從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制一、突變的意義（一）突變是進化、分化的分子基礎(chǔ)（二）突變導(dǎo)致基因型改變（三）突變導(dǎo)致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制二、引發(fā)突變的因素物理因素紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制化學(xué)因素目錄大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制三、突變的分子改變類型錯配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制DNA分子上的堿基錯配稱點突變(pointmutation)。發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。

2.顛換（一）錯配大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制鐮形紅細胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

·

his

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leu

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thr

·

pro·

val

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glu

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C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

·

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glu

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glu

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C肽鏈CTCGAG基因大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制（二）缺失、插入和框移缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。框移突變是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。缺失或插入都可導(dǎo)致框移突變。大學(xué)生物化學(xué)第10章復(fù)制谷酪蛋絲5’