《內(nèi)分泌干擾物檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因斑馬魚法》編制說(shuō)明

1《內(nèi)分泌干擾物檢測(cè)轉(zhuǎn)基因斑馬魚法》編制說(shuō)明斑馬魚作為一種小型脊椎類模式生物，在全球范圍內(nèi)已有90多年的研究歷史，在藥品、保健食品及食品等領(lǐng)域的應(yīng)用已得到大量相關(guān)領(lǐng)域企業(yè)的認(rèn)可。斑馬魚試驗(yàn)既有體外試驗(yàn)快速、高效的特點(diǎn)，又具備哺乳動(dòng)物試驗(yàn)相關(guān)性好、預(yù)測(cè)性高的特點(diǎn)，并且符合國(guó)際動(dòng)物福利保護(hù)趨勢(shì)，當(dāng)下已經(jīng)取得了顯著的科研和在此背景下，環(huán)特生物向中國(guó)乳制品工業(yè)協(xié)會(huì)提交請(qǐng)。中國(guó)乳制品工業(yè)協(xié)會(huì)組織專家召開(kāi)的標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)審核論證會(huì)通過(guò)了該團(tuán)標(biāo)的立項(xiàng)申請(qǐng)，并確定由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司牽頭承擔(dān)標(biāo)準(zhǔn)起草任務(wù)。該項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)旨在建立類雌激素物質(zhì)檢測(cè)的新標(biāo)準(zhǔn)，彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)方法在檢測(cè)敏感性和操作便捷性方面的司、樸誠(chéng)乳業(yè)（集團(tuán)）有限公司、云南云科特色國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心、內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）測(cè)技術(shù)研究所、寧波海關(guān)技術(shù)中心、君樂(lè)寶乳業(yè)集團(tuán)、南京歆佳醫(yī)藥科技有限公起草人名單：徐懿喬、朱曉宇、曹兵兵、解慶剛、毛新亮、高業(yè)成、張迎春、王飛飛、代榮波、賈旭東、劉姍、梁晶晶、趙超群、逯剛、董立雅、邱靜、劉漢偉、黃亞芳、周佳麗標(biāo)準(zhǔn)制訂工作的組織、方法開(kāi)發(fā)、方法驗(yàn)證和標(biāo)準(zhǔn)文本提供方法驗(yàn)證的樣品、提供相關(guān)樣品的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)試數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容審核與修訂：浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院、國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心、寧波海關(guān)技術(shù)中心、南京歆佳醫(yī)藥科技有限公標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容審核與修訂：黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司、完美（廣東）有限公司、云南云科特色植物提取實(shí)驗(yàn)室有限公司、內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司、中國(guó)農(nóng)環(huán)境雌激素（EnvironmentalEstrogens化功能的化學(xué)物質(zhì)，三大主要的EEs有1、生物來(lái)源雌激素，2、人工合成雌激素，3、環(huán)制品中天然存在內(nèi)源性雌激素，主要包括雌酮、β-雌二醇、雌三醇，其中β-雌二醇的活性最強(qiáng)，在正2況下含量很低，并不會(huì)擾亂人體的生理機(jī)能和激素代謝；另外還可能有人為添加的，屬于人工合成性雌激素，最具代表性的是二苯乙烯類合成雌激素，主要有己烯雌酚，己二烯雌酚，己烷雌酚等，以進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)干擾動(dòng)物體內(nèi)源性雌激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)合、活性反應(yīng)、代謝、消生類似生物體內(nèi)源性雌激素的作用。而己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚都屬于人工合成的雌性激素，是用。多種可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的代用物的效力都遠(yuǎn)不如己烯雌酚，以致使己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌是己烯雌酚等人工合成的雌性激素在動(dòng)物生產(chǎn)過(guò)程中的使用禁而不止。現(xiàn)已證實(shí)這些人工合成的雌可在動(dòng)物的肝臟、肌肉中殘留。如果人們長(zhǎng)期食用這種激素含量較高的動(dòng)物產(chǎn)品，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生諸如可檢測(cè)有雌激素活性的物質(zhì)的存在方法很多。理化檢測(cè)通常檢測(cè)的是結(jié)構(gòu)已知的物質(zhì)，但雌激繁多，結(jié)構(gòu)差異大，化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性的相關(guān)性難以預(yù)測(cè)。生物學(xué)檢測(cè)可以很好模擬人病理吸收代斑馬魚（Zebrafish）具有個(gè)體小、繁殖率高、生長(zhǎng)周期短、胚胎透明、與人類基因的同源性高、易于進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作并得到基因突變體，成為研究脊椎動(dòng)物環(huán)境毒理學(xué)的理想模式生物。斑馬魚已被歐美和中國(guó)監(jiān)管部門廣泛認(rèn)可，歐洲經(jīng)濟(jì)與合作發(fā)展組織（OECD）已經(jīng)頒布了10余項(xiàng)斑馬魚環(huán)境毒理學(xué)評(píng)價(jià)指南。OECD和日本的生殖毒理學(xué)家采用斑馬魚作為檢測(cè)水環(huán)境內(nèi)分泌干擾物濃度的早期敏感對(duì)中有三個(gè)基因與哺乳動(dòng)物雌激素受體（ERs）同源：erα（在斑馬魚中也稱為或esr2a）和erβ2（nr3a2b或esr2b）。三種雌激素受體均可與雌激素響應(yīng)元件（ERE）本標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因雌激素斑馬魚，建立類雌激素生物學(xué)檢測(cè)新方法，彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)方法在檢測(cè)敏和操作便捷性方面的不足，達(dá)到快速、高效、低成本的篩查品中潛在風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的目的，是對(duì)現(xiàn)行理化檢測(cè)在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開(kāi)展了立項(xiàng)前的行業(yè)調(diào)研工作、召開(kāi)了溝通會(huì)議，廣泛聽(tīng)取行業(yè)意見(jiàn)和建議。杭州環(huán)特生物科技股份有限公司向中國(guó)乳制品在與行業(yè)專家和相關(guān)企業(yè)充分溝通的基礎(chǔ)上，2022年07月21日召開(kāi)了標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)審評(píng)會(huì)，提案單位進(jìn)行了立項(xiàng)答辯。標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)通過(guò)專家審核并在中國(guó)乳制品工業(yè)協(xié)會(huì)官網(wǎng)發(fā)布立項(xiàng)公告。隨后成立了標(biāo)準(zhǔn)工作組。工作組由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司、黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司、完美（廣東）日用品有限公司、樸誠(chéng)乳業(yè)（集團(tuán)）有限公司、云南云科特色植物提取實(shí)驗(yàn)室有限公司、浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院、3國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心、內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所、寧波海關(guān)技術(shù)中心、君樂(lè)寶乳業(yè)集團(tuán)、南京歆佳醫(yī)藥科技有限公司的多位專家組成，正式杭州環(huán)特生物科技股份有限公司等12家單位對(duì)加標(biāo)奶粉的化學(xué)提取方法驗(yàn)證，斑馬魚對(duì)內(nèi)分泌干擾物各標(biāo)準(zhǔn)制定參與單位對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草稿進(jìn)行了充分討論，同時(shí)也多次向行業(yè)專家征求意見(jiàn)。標(biāo)準(zhǔn)編制小組在聽(tīng)取專家建議和意見(jiàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草稿做了進(jìn)一步的修改和完善，形成本標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿。在雌激素作用下，雌激素受體（Estrogenreceptor，ER）ERs的基因在肝臟中的表達(dá)會(huì)明顯上調(diào)。因此，ERs的基因可以作為生物體內(nèi)雌激素活性檢測(cè)的典型生物標(biāo)志物。本方法中使用的雌激素斑馬魚構(gòu)建是以UAS-GFF基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)為基礎(chǔ)，利用優(yōu)化重組的雌激素響應(yīng)元件（ERE）驅(qū)動(dòng)達(dá)，進(jìn)而對(duì)下游UAS質(zhì)粒中熒光基因eGFP表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。類雌激素物質(zhì)能刺激5×ERE響應(yīng)，激活GFF的表達(dá)，而GFF蛋白可與UAS結(jié)合，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白（EGFP）的表達(dá)，從而達(dá)到方便、直觀、動(dòng)態(tài)檢測(cè)Tg（5xERE:GFF;UAS:EGFP）根據(jù)國(guó)內(nèi)外斑馬魚相關(guān)試驗(yàn)的指南和標(biāo)準(zhǔn)，推薦將斑馬魚幼魚的孵育水溫控制在26-28.5℃。溫度偏離這個(gè)范圍的話，斑馬魚的發(fā)育會(huì)出現(xiàn)明顯的延遲或加快，需要相應(yīng)地調(diào)整試驗(yàn)方在收集親魚新繁殖的胚胎時(shí)，需要用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水將胚胎清洗3遍左右，將胚胎卵膜上可能粘連的食物殘?jiān)⒓S便清洗干凈，盡量減少食物殘?jiān)图S便中攜帶的微生物特別是真菌對(duì)胚胎發(fā)育和生長(zhǎng)的影響。除了在收集胚胎時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)部分死亡胚胎之外，有部分胚胎會(huì)因?yàn)榇嬖谧陨淼娜毕荻诎l(fā)育過(guò)程中死亡。因?yàn)?斑馬魚孵育的溫度較高，所以死亡的胚胎很容易腐爛變質(zhì)，如果清理不及時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致水質(zhì)惡化，同時(shí)影響其它胚胎的發(fā)育。根據(jù)斑馬魚的胚胎發(fā)育階段特點(diǎn)，大部分先天因素導(dǎo)致的胚胎死亡發(fā)生在受精后6小時(shí)以內(nèi)，因此，在胚胎受精后6小時(shí)左右或當(dāng)天下班前進(jìn)行清理；在胚胎受精后24小時(shí)再清理一次死胚在胚胎發(fā)育的過(guò)程中，隨著胚胎植物極營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物如果在水體中積累過(guò)多，也會(huì)導(dǎo)致水質(zhì)惡化。因此，至少應(yīng)該每天更換一次胚胎養(yǎng)殖水，每次更換不少于2/3的斑馬魚胚胎和幼魚的孵育可以根據(jù)實(shí)際情況選擇不同的容器，比如培養(yǎng)皿、廣口罐、細(xì)胞培養(yǎng)板、燒杯等。在選擇容器時(shí)，建議選擇用惰性材料制成的容器。孵育時(shí)要注意培養(yǎng)皿中的斑馬魚胚胎和幼魚的密度，通常建議每尾斑馬魚最少100μL液體，液體過(guò)少會(huì)導(dǎo)致斑馬魚生長(zhǎng)空間不足，影響發(fā)育。對(duì)于斑馬魚幼魚培養(yǎng)密度，建議6孔培養(yǎng)板每個(gè)孔不超過(guò)30尾，12孔培養(yǎng)板每個(gè)孔不超過(guò)20尾，24孔培養(yǎng)板每個(gè)孔不超過(guò)10尾，10cm培養(yǎng)皿不超過(guò)150尾；對(duì)于廣口罐和燒杯等大體積容器，建議斑馬魚胚胎和幼魚的數(shù)量控成魚的抵抗力和適應(yīng)能力強(qiáng)，因此對(duì)水質(zhì)的要求不是很嚴(yán)格，可用去離子水加入適量的人工海鹽和碳酸氫鈉（NaHCO3），使水體的重要參數(shù)保持在斑馬魚的適宜范圍內(nèi)即可（電導(dǎo)率維持在480~510胚胎和幼魚對(duì)水質(zhì)的要求比成魚嚴(yán)格，此外，為了減少水質(zhì)波動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，培養(yǎng)液的成分應(yīng)盡量清晰。因此，胚胎和幼魚的孵育建議使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水（40×標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制方法：NaHCO3：2.52（1）樣品的前處理。首先，考慮到斑馬魚實(shí)驗(yàn)體系對(duì)馬魚適宜生長(zhǎng)的溫度28.5℃容易引起水質(zhì)污染，造成斑馬魚缺氧死亡。其次，內(nèi)分泌干擾物的生物效應(yīng)與濃度呈正相關(guān)，一些樣品中內(nèi)分泌干擾物相對(duì)濃度較低，需要增加樣品中類雌激素的濃度。因此，建議樣品通過(guò)化學(xué)提取進(jìn)行前處理。具體方法如下：1）取10g樣品置于50mL離心管中，共4管；2）分別向每個(gè)離心管中加入15mL超純水，渦旋1min，混勻水浴鍋預(yù)熱至35~40℃)超聲5min，之后分別在每個(gè)離心管中加入22.5mL乙腈，渦旋1min，混勻，超聲5min；3）分別向每個(gè)離心管中加入6.0g氯化鈉，渦旋1min,混勻1000rpm，離心10min，將離心完的上清液裝入離心管中；4）將含有上清液的離心管，放置到氮吹儀中，氮吹至干燥，加入4mL甲醇復(fù)溶，隨后將液體移入裝有300mgC18的5mL離心管，渦旋30s，于4000rpm，離心1min，取凈化過(guò)的上清液過(guò)0.22μm濾膜，進(jìn)行過(guò)濾，收集液體。（2）助溶劑的使用。食品的成分較為復(fù)雜，既含有水溶性成分，也含有脂溶性成分，還有一些不溶性成分（如超微粉碎后直接使用的原料粉、益生菌等）。為了讓食品中的有效成分盡量溶解或均勻分散，有時(shí)候不得不使用一些助溶劑，包括有機(jī)溶劑和分散劑。本標(biāo)準(zhǔn)推薦使用的都是相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中推薦或者有相5關(guān)科研文獻(xiàn)證明其對(duì)斑馬魚安全性的助溶劑。推薦的溶劑：丙酮、乙醇、甲醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、三甘醇。推薦的分散劑：聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、吐溫80、0.01%的纖維素甲醚、聚氧乙烯化氫化對(duì)于助溶劑的使用限量，根據(jù)長(zhǎng)期積累的數(shù)據(jù)以及本標(biāo)準(zhǔn)涉及到試驗(yàn)內(nèi)容的特點(diǎn)，本標(biāo)準(zhǔn)將助溶劑的濃度上限定為1%（W/V或V/V）。1%的濃度上限并不意味著所有助溶劑的終濃度都可以用到1%（例如乙醇不應(yīng)超過(guò)0.5%）。在試驗(yàn)溶液配制不受影響的情況下，助溶劑的使用量通常不應(yīng)超過(guò)0.1%。只有當(dāng)樣品溶解性確實(shí)不好且助溶劑安全性非常好的的情況下，方可將助溶劑的終濃度最高增加到1%。如果樣品配制（3）試驗(yàn)溶液的pH。斑馬魚最適的pH是在6.8-7.5之間，pH6.0-8.5可以正常生長(zhǎng)，短期內(nèi)pH5.0-9.0也可以耐受。一旦pH值<5.0或者>9.0，即便是短期內(nèi)也會(huì)對(duì)斑馬魚產(chǎn)生嚴(yán)重傷害。因此，在試驗(yàn)中要盡量使試驗(yàn)溶液的pH值維持在最適宜斑馬魚生長(zhǎng)的范圍內(nèi)。如果加入樣品后試驗(yàn)溶液的pH值有明顯變化，不應(yīng)該直接調(diào)節(jié)試驗(yàn)溶液的pH，因?yàn)闀?huì)改變整個(gè)試驗(yàn)體系；應(yīng)該調(diào)節(jié)樣品貯備液的pH值，使其接近加入樣品為了避免在調(diào)節(jié)pH的時(shí)候引入其它可能影響試驗(yàn)結(jié)果的化學(xué)物質(zhì)，推薦使用HCl和NaOH來(lái)調(diào)節(jié)。為了避免因?yàn)檎{(diào)節(jié)pH導(dǎo)致貯備液的成分和濃度發(fā)生變化，在調(diào)節(jié)pH的過(guò)程中，貯備液的顏色不應(yīng)發(fā)生變（4）在本標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)方法中，斑馬魚是直接暴露在樣品溶液中，為了減少滲透壓過(guò)高對(duì)斑馬魚正常生理活動(dòng)的影響，對(duì)樣品的測(cè)試濃度要設(shè)置一定的上限。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于以小分子單體化合物為主要成分的樣品（如維生素、礦物質(zhì)），測(cè)試濃度上限定為1000μg/mL；對(duì)于成分多樣混合物（如天然植物提取物）或分子量＜3KD的大分子化合物的測(cè)試濃度上限為2000效成分含量或者可溶性成分濃度來(lái)確定測(cè)試上限，通常用體積比表示。對(duì)于很難溶解或很難均勻分散的樣品物質(zhì)，水溶暴露后很難保證斑馬魚的有效吸收，應(yīng)考慮對(duì)樣品必要的前處理或改用水溶暴露以外的其它處理方式。根據(jù)OECD236指南的內(nèi)容，對(duì)于分子量≥3KD的大分子化合物，因?yàn)樯锢枚鹊南拗?，不適合采用水溶暴露方式，應(yīng)考慮對(duì)樣品必要的前處理（5）在日常的試驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)有一些單體成分或者天然提取物自身會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。如果樣品產(chǎn)生熒光的條件（激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)）與內(nèi)分泌干擾物誘發(fā)的綠色熒光相同，就會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的（6）每次試驗(yàn)前需要測(cè)試一次樣品溶液的溶解氧和pH，以確保樣品溶液的溶解氧和pH在正常的范圍內(nèi)，避免水體環(huán)境對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾。在本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的評(píng)價(jià)方法下，換液時(shí)進(jìn)行一次測(cè)試即可，試驗(yàn)終點(diǎn)選擇的是早期發(fā)育過(guò)程中的斑馬魚，這個(gè)階段斑馬魚發(fā)育較快，受精后不同天數(shù)的斑馬魚生理狀態(tài)會(huì)6有很大的差別。因此，斑馬魚發(fā)育階段的選擇就非受精后3天的斑馬魚肝臟開(kāi)始發(fā)育，受精后5天肝臟發(fā)育完全。當(dāng)Tg（5xERE:GFF;UAS:EGFP）品系接觸到內(nèi)分泌干擾物，綠色熒光在肝臟表達(dá)，因此，發(fā)育階段必須選擇受精后3天及以后。通過(guò)大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，斑馬魚暴露在內(nèi)分泌干擾物中24小時(shí)后（即給藥），為了避免因斑馬魚個(gè)體異常或死亡導(dǎo)致試驗(yàn)數(shù)據(jù)不滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求的情況發(fā)生，在造模和樣段，每組的斑馬魚數(shù)量應(yīng)不少于20尾，除特殊情對(duì)于一些已經(jīng)有其它試驗(yàn)數(shù)據(jù)的樣品，可以從兩個(gè)維度來(lái)確定斑馬魚預(yù)試驗(yàn)的濃度設(shè)計(jì)1）根據(jù)已有的其它試驗(yàn)數(shù)據(jù)推算而來(lái)斑馬魚試驗(yàn)濃度2）樣品自身特性所決定的測(cè)試上限。當(dāng)推算得出的試驗(yàn)濃度超出本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定該類別樣品的測(cè)試上限或樣品自身的溶解度上限時(shí)，以測(cè)試上限或溶解度上限為預(yù)試驗(yàn)的最高濃度，然后向下設(shè)計(jì)一系列濃度，其中需要包含推算得出的試驗(yàn)濃度；當(dāng)推算得出的試驗(yàn)濃度不高于本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定該類別樣品的測(cè)試上限和樣品自身的溶解度上限時(shí)，可以將推算得出的試驗(yàn)濃度作對(duì)于沒(méi)有其它試驗(yàn)數(shù)據(jù)的樣品，直接根據(jù)樣品自身特性所決定的測(cè)試上限（本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定該類別樣品根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，預(yù)試驗(yàn)的樣品試驗(yàn)濃度范圍跨度不應(yīng)小于10，濃度范圍跨度過(guò)小，可能無(wú)法通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定樣品的無(wú)可觀察毒性效應(yīng)濃度（NOEC）；同時(shí)，濃度的間隔系數(shù)不大于3.2，濃度的間隔系數(shù)過(guò)大，可能導(dǎo)致試驗(yàn)確定的NOEC值遠(yuǎn)小于真實(shí)的最高安全濃度，導(dǎo)致后續(xù)正式試驗(yàn)的測(cè)試濃度偏低，可能影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。正式試驗(yàn)的樣品濃度的間隔系數(shù)同樣不能大于3.2，樣品的濃度組別數(shù)可以根據(jù)需要設(shè)置，一般不應(yīng)少于3組。濃度間隔系數(shù)過(guò)大或者濃度組別過(guò)少，可能都會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的偏差，無(wú)法充分隨機(jī)選取至少10尾斑馬魚用甲基纖維素固定在體視（熒光）顯微鏡下觀察拍照，拍照部位為從斑馬魚頭部至卵黃囊，通常需要采集完整的全身明場(chǎng)圖片用于制作示意圖。拍照時(shí)斑馬魚應(yīng)頭朝左、腹部朝下、照片的拍攝效果主要取決于顯微鏡的放大倍數(shù)和光源條件等，要求背景干擾小、圖像清晰、定量區(qū)域肝臟完全落在視野范圍之內(nèi)。實(shí)際工作中，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室顯微鏡的配置情況適當(dāng)調(diào)整拍照參數(shù)，但同一次試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)在相同的條件下進(jìn)行拍照，通常要求體視顯微鏡的放大倍數(shù)不低于20倍，拍照系統(tǒng)的像素不低7拍照完成后，可以使用熒光顯微鏡廠家配備的圖像分析軟件或者其它的專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行分析。在分析時(shí)，將斑馬魚肝臟設(shè)置為感興趣區(qū)域（ROI，regionofinter它類似指標(biāo)）。有些圖像分析軟件可以直接計(jì)算ROI的光密度總和，有些圖像分析軟件只能通過(guò)分別計(jì)算ROI總面積和光密度平均值來(lái)計(jì)算得到ROI的光密度總和（ROI光密度=ROI面積×ROI光密度平均值）。用分析得到的ROI熒光總和值來(lái)表示斑馬魚肝臟類雌激素物質(zhì)的含量。將圖像分析得到的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算各組試驗(yàn)的平均值（Mean）及標(biāo)準(zhǔn)誤差（StandardError，SE），統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用Mean±SE表示。與平均值相差2個(gè)SD以上的數(shù)據(jù)可以按照異常數(shù)據(jù)予以剔除，每組數(shù)據(jù)最多只能剔除2個(gè)異常數(shù)據(jù)。剔除掉異常數(shù)據(jù)之后，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。宜采用方差分析，按方差分析的程序先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)（P值）和方差齊性檢驗(yàn)（F值）。當(dāng)F<0.05，P<0.05時(shí)，各組均數(shù)間組間至少有一組有顯著性差異，宜采用非參數(shù)檢驗(yàn)。當(dāng)F≥0.05，P≥0.05時(shí)，采用單因素方差分析，選擇事后兩兩比較的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊性的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。樣品處理組與溶劑對(duì)照組相比較，P<0.05表明統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。受試樣品各濃度組與溶劑對(duì)照組比較，任一濃度組肝臟熒光強(qiáng)度總和升高，差異有顯著性，可判定該根據(jù)前期積累的大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)，當(dāng)且僅當(dāng)一個(gè)試驗(yàn)滿足如下的質(zhì)量控制要求時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果的有效性才（1）正常對(duì)照組（如果使用了助溶劑，也包括溶劑對(duì)照組）斑馬魚的死亡率或異常率不得超過(guò)（2）正式試驗(yàn)中，如果使用了助溶劑，溶劑對(duì)照組與正常對(duì)照組之間不能存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，如果溶劑對(duì)照組與正常對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)（3）正式試驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照組與正常對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，否則該次試驗(yàn)結(jié)果視8乙腈中8種甾體激素混標(biāo)溶液（GB31658.9-2021&農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第282號(hào)-1-2020）和乙腈中8種甾體激素內(nèi)標(biāo)混標(biāo)溶液（GB31658.9-2021內(nèi)標(biāo)&農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第282號(hào)-1-2020）具體信息Z,Z-雙烯雌酚-D6條件參考《GB31658.9-2021食品安全國(guó)家標(biāo)98種內(nèi)分泌干擾加標(biāo)回收結(jié)果顯示平均回收率在87.730~106.275%，在標(biāo)準(zhǔn)文本確定后，本標(biāo)準(zhǔn)提出單位與各參與單位協(xié)商，確定了共計(jì)4種內(nèi)分泌干擾物陽(yáng)性化合物和2種內(nèi)分泌干擾物陰性化合物，這些化合物是否具有內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)均有文獻(xiàn)報(bào)道，用于對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)所述試123456除本標(biāo)準(zhǔn)提出單位杭州環(huán)特生物科技股份有限公司之外，另有兩家從標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法的驗(yàn)證工作。驗(yàn)證單位和人員的詳細(xì)信息本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的試驗(yàn)方法的測(cè)試結(jié)果受多種因素的影響，如樣品處理方式、斑馬魚胚胎的質(zhì)量狀況、拍照技術(shù)、定量方法等。因此，為了驗(yàn)證方法的一致性，我們組織了協(xié)同驗(yàn)證試驗(yàn)，由三家具有斑馬魚試驗(yàn)?zāi)芰Φ膶?shí)驗(yàn)室單位，在相同的試驗(yàn)條件下對(duì)同一樣品標(biāo)準(zhǔn)提出單位杭州環(huán)特生物科技股份有限公司、驗(yàn)證單位1寧波海關(guān)技術(shù)中心、驗(yàn)證單位2南京歆佳醫(yī)藥科技股份有限公司分別按照本標(biāo)準(zhǔn)文本中的方法對(duì)表1中所列的全部6種樣品進(jìn)行內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)評(píng)價(jià)。3家驗(yàn)證單位的試驗(yàn)結(jié)果表明，上述4種內(nèi)分泌干擾物陽(yáng)性化合物（雌二醇、4-叔辛基苯酚、雙酚A和炔雌醇）在斑馬魚評(píng)價(jià)試驗(yàn)中均呈陽(yáng)性反應(yīng)，2種內(nèi)分泌干擾物陰性化合物（11-酮睪酮和地塞米松）均三家驗(yàn)證單位用同樣的方法測(cè)試同一個(gè)樣品，結(jié)果顯示不同實(shí)驗(yàn)室之間斑馬魚內(nèi)分泌干擾物陽(yáng)性化合物和陰性化合物含量非常接近，測(cè)試結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差達(dá)到20%以內(nèi)，說(shuō)明不同實(shí)驗(yàn)室之間的重復(fù)性較本標(biāo)準(zhǔn)制定過(guò)程中查到同類國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)：OECDTG250EASZYassay:DetectionofEndocrineActiveSubstances,actingthroughestrogenreceptors,usingtransgenictg(cyp19a1b:GFP)Zebraf在的危害。世界衛(wèi)生組織和國(guó)際化學(xué)品安全規(guī)劃(WHO/IPCS)將內(nèi)分泌干擾物定義為能改變內(nèi)分泌功能并對(duì)生物體或子代造成不良影響的外源物質(zhì)。2021年我國(guó)明確將內(nèi)分污染物。本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施有利于政府監(jiān)管部門管控內(nèi)分泌干擾物的使用，規(guī)范市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)，打擊非法添加生產(chǎn)行為，倒逼企業(yè)進(jìn)一步提高生產(chǎn)質(zhì)量水平，壓縮違法生產(chǎn)企業(yè)市場(chǎng)生存空間，維護(hù)健康的市場(chǎng)秩序，為人民食品安全保駕護(hù)航。減少內(nèi)分泌干擾物的攝入將減少免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的疾病發(fā)生、發(fā)[1]孫沛雯,王中衛(wèi),李翔宇,等.不同水體中環(huán)境類雌激素污染狀況調(diào)查與分析[J].干旱環(huán)境監(jiān)測(cè),[2]DuB,FanG,YuW,etal.OccurrenceandriskassessmentofAfive-yearworldwideperspective[J].EnvironPollut,2020,267:115405.[3]AdeelM,SongX,WangY,etal.Environmentalimpactofestrogensonhuman,animalandplantlife:Acriticalreview[J].EnvironInt,2017,99:107-119.YilmazB,TerekeciH,SandalS,etal.Endocrinedisruptingchemicals:exposure,effectsonhumanhealth,mechanismofaction,modelsfortestingandstrategiesforprevention[J].RevEndocrMetabDisord,2020,21(1):127-147.[4]羅書.全自動(dòng)固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定養(yǎng)殖場(chǎng)廢水中6種常見(jiàn)環(huán)境雌激素的殘留量[J].理化檢驗(yàn)-化[5]劉小紅,鄧華,常林,等.環(huán)境雌激