CEA siRNA載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細(xì)胞的沉默作用

1/1CEAsiRNA載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細(xì)胞的沉默作用CEAsiRNA載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細(xì)胞的沉默作用【摘要】目的：

應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建針對(duì)CEA的siRNA載體，抑制人食管癌EC9706細(xì)胞CEA基因的表達(dá).方法：

依據(jù)設(shè)計(jì)siRNA的原則，針對(duì)人CEA的mRNA序列，設(shè)計(jì)并合成編碼siRNA的兩對(duì)寡核苷酸序列，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，克隆入載體pRNATU6.2中構(gòu)建重組體pRNATU6.2CEA，篩選、鑒定.然后轉(zhuǎn)染重組體至人食管癌EC9706細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選，獲得陽(yáng)性克隆，并以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的EC9706作對(duì)照，運(yùn)用PCR和WesternBlot檢測(cè)CEA的表達(dá).結(jié)果：

測(cè)序鑒定證實(shí)目的寡核苷酸片斷已被克隆到pRNATU6.2載體中，pRNATU6.2CEA轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細(xì)胞后，CEA基因表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平都受到顯著抑制.結(jié)論：

成功構(gòu)建了針對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞的siRNA載體，可有效抑制CEA的表達(dá)，為進(jìn)一步從分子水平探討CEA的功能奠定了基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】EC9706細(xì)胞系干擾RNA癌胚抗原0引言CEA（carcinoembryonicantigen）屬于非器官特異性腫瘤相關(guān)抗原，它不僅作為一種單純的腫瘤標(biāo)志物存在,而且是與腫瘤惡性化有關(guān)的一種復(fù)雜的分子.但目前對(duì)于CEA分子水平的研究主要集中在腫瘤治療前、治療中、治療后CEA表達(dá)的變化及其與腫瘤診斷、治療、預(yù)后的關(guān)系［1-3］.CEA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有無(wú)內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)治療過(guò)程有什么影響，文獻(xiàn)中未見(jiàn)深入報(bào)道.本研究利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建針對(duì)CEA的小分子干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞，旨在實(shí)現(xiàn)對(duì)CEA表達(dá)的抑制，為進(jìn)一步從分子水平探討CEA功能及對(duì)治療的影響打下基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料人食管癌EC9706細(xì)胞系由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng).大腸桿菌Top10,pRNATU6.2質(zhì)粒由鄭州大學(xué)免疫與微生物教研室提供.限制性?xún)?nèi)切酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RealTimePCR擴(kuò)增試劑盒均為T(mén)aKaRa產(chǎn)品.鼠抗人CEA及actinmAb和酶標(biāo)羊抗鼠IgG為Sigma公司產(chǎn)品.CEA基因RNAi寡核苷酸，CEA基因和actin基因PCR引物均由上海生物工程公司合成測(cè)序.1.2方法1.2.1引物設(shè)計(jì)在GenBank中查找人CEA的mRNA全序列，通過(guò)Blast軟件確定與其它非相關(guān)基因無(wú)同源性，按照pRNATU6.2載體的要求設(shè)計(jì)編碼siRNA的寡核苷酸鏈.設(shè)計(jì)的siRNA兩對(duì)寡核苷酸序列如下：

SCEA1上游引物為5TGATGGCAACCGTCAAATTATTCAAGAGATAATTTGACGGTTGCCATCTTTTTTC3，下游引物為5TCGAGAAAAAAGATGGCAACCGTCAAATTATCTCTTGAATAATTTGACGGTTGCCATCA3；SCEA2上游引物為5TGATGTAGGACCCTATGAGTTTCAAGAGAACTCATAGGGTCCTACATCTTTTTTC3，下游引物為5TCGAGAAAAAAGATGTAGGACCCTATGAGTTCTCTTGAAACTCATAGGGTCCTACATCA3.RealTimePCR一對(duì)引物5ACCACAGTCACGACGATCAC3，5CGCTGTGGTCAACACTTAAT3.1.2.2siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建將合成的寡核苷酸單鏈稀釋后退火成雙鏈，連接到siRNA載體pRNATU6.2，將重組載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌（Top10），篩選，PCR驗(yàn)證后提取質(zhì)粒，并做雙酶切和測(cè)序鑒定.1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染取pRNATU6.2SCEA1，SCEA2重組體及空載體分別轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC9706細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明進(jìn)行，轉(zhuǎn)染24h后用G418(濃度400mg/L)篩選，待細(xì)胞穩(wěn)定后收集，同時(shí)收集同批未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的EC9706作為陰性對(duì)照，分別命名為干擾1組、干擾2組、空載體組及對(duì)照組.1.2.4RealTimePCR分析Trizol法提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的總RNA（方法按試劑盒說(shuō)明），逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈（Gbico公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒及說(shuō)明）.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立：

將actin質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品原液按梯度稀釋成0.1，0.05，0.025，0.0125，0.00625拷貝/L.使用RealTimePCR擴(kuò)增儀進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件中加入溶解曲線(xiàn)的制備.1.2.5WesternBlot檢驗(yàn)CEA蛋白的表達(dá)培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備：

收集各組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液和蛋白保護(hù)液裂解細(xì)胞，經(jīng)渦旋離心后取上清，紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度備用；制備SDSPAGE凝膠，并做預(yù)電泳；每孔加樣品40g，Marker加10L，電泳；染色和脫色，切膠.電轉(zhuǎn)；封閉，加1抗孵育，TBST洗后加酶標(biāo)2抗；TBST洗后，顯影，定影；用actin作內(nèi)參照驗(yàn)證蛋白的含量.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：

組間比較采用單因素方差分析，Plt;0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1重組體鑒定結(jié)果2.1.1酶切鑒定重組質(zhì)粒經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切后得到大于2000bp的條帶和小于100bp的條帶，與質(zhì)粒和目的條帶的大小相符(圖1).1：

pRNATU6.2SCEA1；2：

pRNATU6.2SCEA2；3：

marker.圖1重組載體的雙酶切鑒定2.1.2測(cè)序鑒定經(jīng)過(guò)篩選的重組體pRNATU6.2SCEA1，SCEA2測(cè)序結(jié)果，與設(shè)計(jì)靶向CEA的寡核苷酸序列比較完全一致(圖2).圖2重組體插入片斷（SCEA1，2）的測(cè)序結(jié)果2.2CEAsiRNA轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞的RealTimePCR鑒定2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立和回歸方程用SPSS11.0軟件對(duì)actin質(zhì)粒稀釋濃度的對(duì)數(shù)和相應(yīng)的拷貝數(shù)進(jìn)行直線(xiàn)回歸分析.得到的直線(xiàn)回歸方程為lgY=-0.575-0.397X.模板的溶解曲線(xiàn)顯示為單峰，且峰值單一，說(shuō)明產(chǎn)物特異（圖3）.圖3RealTimePCR熔解曲線(xiàn)2.2.2樣品的定量檢測(cè)分別以CEA和actin為引物擴(kuò)增樣本，其CT值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，求出相應(yīng)的mRNA含量，并求出樣本中CEAmRNA對(duì)actinmRNA的相對(duì)含量，對(duì)照、空載體（pRNATU6.2）、干擾1（pRNATU6.2SCEA1）及干擾2（pRNATU6.2SCEA2）分別為：

0.180.11,0.190.10,0.060.02,0.050.03.干擾1組、干擾2組與對(duì)照組及空載體組相比，都有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）.2.3CEAsiRNA轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞的WesternBlot鑒定干擾1組和干擾2組與對(duì)照組、空載體組相比蛋白條帶明顯減弱（圖4).1：

對(duì)照；2：

空載體；3：

干擾1；4：

干擾2.圖4WesternBlot鑒定結(jié)果3討論CEA是一種胚胎性致癌抗原,主要存在于胎兒消化道上皮組織、胰腺和肝臟中,成人消化道可產(chǎn)生少量CEA,在膽道、羊水、肺、乳腺等組織中也可見(jiàn)少量CEA.約95%的結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、大多數(shù)非小細(xì)胞型肺癌、頭頸鱗癌及約50%的乳腺癌有CEA表達(dá)［4］.Nakashima等［5］用RTPCR方法對(duì)54例食管癌外周血CEAmRNA進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為57.4%,且陽(yáng)性患者的腫瘤復(fù)發(fā)率明顯高于陰性患者.我們?cè)谘芯繌?fù)制選擇性溶瘤腺病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)CEA在對(duì)溶瘤病毒敏感和不敏感腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)有較大差異，同時(shí)檢測(cè)到CEA在人食管癌EC9706細(xì)胞中高表達(dá)，而且食管癌對(duì)溶瘤腺病毒敏感性不高.因此，希望通過(guò)RNA干擾技術(shù)構(gòu)建CEAsiRNA載體來(lái)降低EC9706細(xì)胞中CEA的表達(dá)，以進(jìn)一步探討CEA的內(nèi)在功能及對(duì)溶瘤腺病毒抗食管癌的效果有無(wú)改善.RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默技術(shù)，又稱(chēng)轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)［6］.RNAi技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅速，已成為分子生物學(xué)研究的主要技術(shù)手段之一，在功能基因組研究、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究及基因治療方面顯示出巨大的前景.研究表明，利用質(zhì)粒或病毒載體體內(nèi)合成的siRNA，體內(nèi)抑制目的基因的效果與合成siRNA相似，但卻花費(fèi)低、成本小，還可克服合成siRNA可能造成的RNase的污染［7］.本研究利用pRNATU6.2載體，構(gòu)建的重組體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，siRNA將持續(xù)產(chǎn)生，并通過(guò)識(shí)別、降解具有同源序列的mRNA最終干擾目的基因的表達(dá)，同時(shí)載體上帶有免疫熒光標(biāo)記利于觀(guān)察重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率.本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的針對(duì)CEA的siRNA表達(dá)載體成功的轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞，用RealTimePCR及WesternBlot方法從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)表明轉(zhuǎn)染特異的siRNA能夠抑制人食管癌EC9706細(xì)胞中CEA的表達(dá)，基因沉默的效果顯著.這證實(shí)我們可以通過(guò)RNAi技術(shù)調(diào)控CEA表達(dá)，為進(jìn)一步探討CEA的功能及對(duì)溶瘤腺病毒的殺傷效果有無(wú)影響及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】［1］SunuchiK,MachinamiR,MoriM,etal.Clinicalimpactofcarcinoembryonicantigenmessengerribonucleicacidexpressionintumordrainingveinbloodonpostoperativelivermetastasisinpatientswithcolorectalcarcinoma:Aprospective,cohortstudy［J］.DisColonRectum,2003,46(4):467-473.［2］徐秀云.CEA與CA50聯(lián)合檢測(cè)鑒別消化系統(tǒng)良惡性疾?。跩］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,3(14):1314.［3］張建華,鐘懷印,薛承巖.CEAmRNA2CEAp系統(tǒng)在良惡性腹水中表達(dá)差別的臨床意義［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,26(24):2277-2279.［4］GuadagniF,KantorJ,AloeS,etal.DetectionofbloodbornecellsincolorectalcancerpatientsbynestedreversetranscriptionpolymerasechainreactionforcarcinoembryonicantigenmessengerRNA:Longitudinalanalysesanddemonstrationofitspotentialimportanceasanadjuncttomultipleserummarkers［J］.CancerRes,2001,61(6):2523-2532.［5］NakashimaS,NatsugoeS,MatsumotoM,etal.Clinicalsignificanceofcirculatingtumorcellsinbloodbymoleculardetectionandtumormarkersinesophagealcancer［J］.Surgery,2003,133(2):162-169.