重組DNA技術(shù)的基本工具課件 【知識精講精研】 高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

楊貴平選擇性必修三第3章基因工程第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降。科學(xué)家通過精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？轉(zhuǎn)基因番木瓜（左）與非轉(zhuǎn)基因番木瓜（右）從社會(huì)中來一、基因工程的概述1.基因工程的概念：指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作DNA重組技術(shù)。重組DNA技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品基因重組定向改造生物性狀；克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙科技探索之路2.基因工程的誕辰和發(fā)展：3.圖解“基因工程實(shí)質(zhì)”轉(zhuǎn)移A生物B生物螢火蟲普通動(dòng)植物發(fā)光基因一、基因工程的概述4.基因工程的理論基礎(chǔ)拼接的基礎(chǔ)1.DNA的基本組成單位相同（四種脫氧核苷酸）表達(dá)的基礎(chǔ)2.都遵循堿基互補(bǔ)配對原則3.DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)1.基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)與功能單位2.遺傳信息的傳遞都遵循中心法則3.生物界幾乎共用一套遺傳密碼基因在空間上轉(zhuǎn)移并成功表達(dá)接剪運(yùn)一、基因工程的概述“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車”二、限制酶——“分子手術(shù)刀”1.來源：主要是從原核生物中分離純化（限制酶不是一種酶，而是一類酶）識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。2.作用:5'3'5'3'TAGGTATCCA1’2’3’4’5’

A1’2’3’4’5’G磷酸二酯鍵你能根據(jù)所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完整的防御機(jī)制。限制酶就是它的一種防御工具。當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，它就會(huì)利用限制酶來切割外源DNA,使之失效以保證自身的安全。二、限制酶——“分子手術(shù)刀”當(dāng)限制酶在它識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端;當(dāng)限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時(shí)，產(chǎn)生的是平末端。3.結(jié)果:產(chǎn)生黏性末端或平末端。4.限制酶的識別序列的特點(diǎn)(1)大多數(shù)限制酶的識別序列均為6個(gè)核苷酸組成，如EcoRI、SmaI限制酶(2)少數(shù)限制酶的識別序列由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成(3)實(shí)例EcoRI(在G與A之間切割)識別序列：GAATTCSmaI(在G與C之間切割)5'5'5'5'3'3'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'識別序列：CCCGGG黏性末端平末端識別序列的特點(diǎn)：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是奇數(shù)個(gè)堿基還是偶數(shù)個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。思考·討論同種限制酶產(chǎn)生的黏性末端相同，不同的限制酶可能會(huì)形成相同的黏性末端。1.請寫出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？提示：

二、限制酶——“分子手術(shù)刀”2.請判斷：以下黏性末端是由幾種限制酶作用產(chǎn)生的。3三、DNA連接酶——“分子縫合針”1.作用:將兩個(gè)雙鏈DNA片段連接起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。2.種類:磷酸二酯鍵(形成)3.作用部位:注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的兩條單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！核心歸納1.比較DNA連接酶和DNA聚合酶（P72旁欄思考）三、DNA連接酶——“分子縫合針”2.與核酸相關(guān)的幾種酶的比較三、DNA連接酶——“分子縫合針”基因工程用酶DNA復(fù)制用酶存在于病毒中核心歸納1．種類：質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等2．常用載體——質(zhì)粒(1)本質(zhì)：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。(2)作用①作為運(yùn)輸工具，將外源基因?qū)爰?xì)胞。②質(zhì)粒攜帶外源DNA片段在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。四、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體—“分子運(yùn)輸車”①能在受體細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定保存②有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，便于插入（攜帶）目的基因③具有標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選（3）運(yùn)載體需具備的條件：

標(biāo)記基因通常有:抗生素的抗性基因，如：抗氨芐青霉素基因(ampr)、抗四環(huán)素基因(tetr)。熒光蛋白基因，如：綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)。④對受體細(xì)胞無毒害作用。思考·討論重組DNA分子請?jiān)趦蓮埣埳戏謩e寫上下列兩段DNA序列:5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3'3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5'5'-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3'3'-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5'5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCCATAC-

3'3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAGGTATG-5'請你找到兩條片段上EcoRI限制酶的識別序列和切割位點(diǎn)。然后，用剪刀“切割”并用透明膠粘連重組形成新的DNA序列。討論：1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？限制酶、DNA連接酶2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對？如果不能，可能是什么原因造成的？可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能稱得上一個(gè)基因嗎？不能。因?yàn)榛虻拈L度一般在100個(gè)堿基對以上。探究·實(shí)踐（一）、實(shí)驗(yàn)原理1．提取DNA的原理利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。如：(1)DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。(2)DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。2．鑒定DNA的原理在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。五、DNA的粗提取與鑒定DNA+二苯胺沸水浴藍(lán)色親子鑒定00.142NaCI濃度（mol/L）探究·實(shí)踐五、DNA的粗提取與鑒定DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA。（二）、材料用具1.選材：2.試劑：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用注意EDTA（乙二胺四乙酸）:是一種DNA酶抑制劑，可以防止細(xì)胞破碎后DNA酶降解DMA。SDS(十二烷基硫酸鈉):可使蛋白質(zhì)變性與DNA分離。Tris（三羥甲基氨基甲烷）：提供緩沖體系，DNA在這個(gè)緩沖體系呈穩(wěn)定狀態(tài)。可用家用洗潔精或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的洗衣粉水溶液替代。第一步第四步第三步研磨加酒精析出溶解與鑒定稱取約30g洋蔥切碎，放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液，靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA將絲狀物或沉淀物溶于試管中的NaCl溶液中。然后，向試管中各加入4mL的二苯胺試劑鑒定（注意做對照實(shí)驗(yàn)）第二步提取上清液研磨液過濾到燒杯中，置于4℃冰箱中，幾分鐘后，再取上清液（也可以通過離心處理后再取上清液）探究·實(shí)踐五、DNA的粗提取與鑒定（三）、方法步驟探究·實(shí)踐五、DNA的粗提取與鑒定（三）、方法步驟稱取約30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。去除濾液中的雜質(zhì)1．取材、研磨:2．過濾：3.DNA的析出加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。探究·實(shí)踐4.DNA的鑒定取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶解于其中一支試管的NaCl溶液中，再向兩支試管中加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜诜兴屑訜?min，待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。鑒定結(jié)果AB5.結(jié)論：DNA在沸水浴的情況下遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色鑒定DNAAB不進(jìn)行任何處理加絲狀物或沉淀加4mL二苯胺，混勻加4mL二苯胺，混勻沸水浴5min沸水浴5min溶液不變藍(lán)色溶液逐漸變成藍(lán)色DNA在沸水浴的情況下遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色五、DNA的粗提取與鑒定（四）、結(jié)果分析與評價(jià)探究·實(shí)踐五、DNA的粗提取與鑒定1.你提出白色絲狀物或沉淀物了嗎?用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何?提示：觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的會(huì)質(zhì)較多。二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功;如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過程中出現(xiàn)了失誤等。2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質(zhì)嗎?提示：本實(shí)驗(yàn)粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。3.與其他同學(xué)提取的DNA進(jìn)行比較，看看實(shí)驗(yàn)結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因。提示：本實(shí)驗(yàn)可以采取分組的方式進(jìn)行?？梢赃x取不同的實(shí)驗(yàn)材料;也可以在閱資料了解其他提取DNA的方法，對同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試劑顯色的深淺等，看看哪種實(shí)驗(yàn)材料、哪種提取方法的效果更好。《3年高考2年模擬》課堂練習(xí)1．限制酶a和b的識別序列和切割位點(diǎn)如圖所示．下列有關(guān)說法錯(cuò)誤的是（）A．a(chǎn)酶與b酶切斷的化學(xué)鍵相同B．能被b酶識別并切割的序列也能被a切割C．在相同的DNA分子中a酶的識別位點(diǎn)一般明顯要比b酶多D．將大量a酶和b酶切割后的片段混合，重新連接后的DNA片段不一定全都能被a切割D《3年高考2年模擬》2.圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。（1）在基因工程的操作中，不宜選用SmaI，原因是SmaI會(huì)破壞__________和__________________________。（2）在基因工程的操作中，不宜選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，___________________________________________________。目的基因質(zhì)粒上的抗生素抗性基因目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中（3）由于反應(yīng)體系中含有大量的外源DNA片段和質(zhì)粒，加入PstI一種限制酶后，會(huì)得到大量的目的基因片段和質(zhì)粒片段，再加入DNA連接酶后，除了會(huì)形成目的基因與質(zhì)粒連接的環(huán)狀產(chǎn)物外，還會(huì)形成______________________連接的環(huán)狀產(chǎn)物以及_____________________連接的環(huán)狀產(chǎn)物。此外，目的基因與質(zhì)粒的連接既可以是正向連接，也可以是____________，后者可能會(huì)導(dǎo)致目的基因無法正