PKCα-βⅡ-η-ζ在腎血管性高血壓大鼠中表達(dá)

1/1PKCα-βⅡ-η-ζ在腎血管性高血壓大鼠中表達(dá)1PKC\Ⅱ\\在腎血管性高血壓大鼠中表達(dá)[摘要]目的:研究PKC、Ⅱ、、在腎血管性高血壓大鼠心肌中的表達(dá),探討PKC亞型在高血壓發(fā)病機(jī)制中的作用。

方法:腎血管性高血壓大鼠模型制備成功后,提取部分心肌組織,采用WesternBlot測定PKC、Ⅱ、、的表達(dá)情況。

結(jié)果:PKC、Ⅱ、、表達(dá)在假手術(shù)組術(shù)前、術(shù)后無明顯變化;手術(shù)組PKC、Ⅱ表達(dá)較術(shù)前無明顯變化,PKC表達(dá)較術(shù)前減少,PKC術(shù)后無表達(dá)。

結(jié)論:PKC、Ⅱ可能未直接參與高血壓的發(fā)病。

PKC術(shù)后表達(dá)下降考慮與高血壓發(fā)病相關(guān),然而其發(fā)病機(jī)制尚需進(jìn)一步探討,推測可能與其促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖有關(guān)。

PKC作用于AngⅡ誘導(dǎo)的ERK途徑的活化,ERK激活增加,從而導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖,血壓升高。

PKC、在高血壓的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。

[關(guān)鍵詞]腎血管性高血壓大鼠;蛋白激酶C(PKC);細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶[中圖分類號(hào)]R-332[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1673-7210(2010)04(a)-027-03TheexpressionofproteinkinaseC,Ⅱ,,inratswithrenovascularhypertensionWANGHaixia,LIUShaokui,ZHANGDianlong2(TheAffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,China)[Abstract]Objective:ToinvestigatetheexpressionofproteinkinaseC(PKC),Ⅱ,andinratswithrenovascularhypertension,andtheeffectofsubtypesofPKConhypertensionwasalsoinvestigated.Methods:Renovascularhypertensionmodelsofratswereestablished.PKC,Ⅱ,andweredetectedincardiacmusclebyWesternBlot.Results:TheexpressionofPKC,Ⅱ,andofsham-operationgrouphadnoobviouschangebeforeandafteroperation.TheexpressionofPKCandⅡofoperationgroupafteroperationwerethesameasthatbeforeoperation,theexpressionofPKCafteroperationwasdecreased.PKCshowednoexpressionafteroperation.Conclusion:PKCandⅡmaydonotdirectlyparticipateintheeffectofhypertension.TheexpressiondecreasingofPKCafteroperationwouldberelatedtotheeffectofhypertension,itspathogenesyshouldbefurtherinvestigated.Itmayberelatedtotheproliferationofepidermiccells.PKCcanleadtovascularsmoothmusclecellproliferationandrisingofbloodpressurethroughERKactivationpathwayand3upregulationofERK,PKCandplayimportantrolesintheprocessoftheoccurrenceanddevelopmentofhypertension.[Keywords]Renovascularhypertensionmodelsofrats;ProteinkinaseC(PKC);Extracellularlyresponsivekinase(ERK)隨著生活水平的日益提高,高血壓的發(fā)病率逐年上升,由此引起的心衰更成為危害人類健康并致死的主要危險(xiǎn)因素之一。

目前有關(guān)高血壓的研究很多,但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,有報(bào)道認(rèn)為蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)各亞型在高血壓、心肌肥厚的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用[1]。

本文通過檢測高血壓大鼠模型心肌PKC、Ⅱ、、的表達(dá)情況,探討PKC亞型在高血壓發(fā)病機(jī)制中的作用。

1材料與方法1.1腎血管性高血壓大鼠模型的制備實(shí)驗(yàn)選用42只正常血壓Wistar大鼠,均為雄性,體重165～180g,在大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(遼:scxk2002-0002;遼:syxk2002-0005)。

大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、手術(shù)組、假手術(shù)組。

模型制備:氯胺酮麻醉后備皮,取腹部正中切口開腹,分離后暴露一側(cè)腎動(dòng)脈,針灸銀針緊貼在左腎動(dòng)脈,用手術(shù)絲線將兩者一起結(jié)扎后,抽去銀針,逐層關(guān)腹,術(shù)后腹腔內(nèi)注射青霉素預(yù)防感染。

假手術(shù)組除不結(jié)扎腎動(dòng)4脈外,其他手術(shù)步驟相同。

術(shù)后10周腎血管性高血壓大鼠模型成功建立[2],大鼠全部處死,取心肌組織,低溫液氮下保存。

1.2PKC、Ⅱ、、的提取和活性測定取部分心肌組織提取蛋白并定量,用聚丙烯酰胺變性凝膠分離蛋白(上樣量為40g總蛋白),將蛋白電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上,封閉后加一抗(1∶2000稀釋)、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶1000稀釋),用化學(xué)發(fā)光試劑NCIP/BCIP顯影,X線片壓片曝光,凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果,重復(fù)3次(全部一抗、二抗試劑來自SantaCruzBiotechnology)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以SPSS10.0軟件處理,組間進(jìn)行t檢驗(yàn),P0.05)。

見圖1、2。

2.2手術(shù)組PKC、Ⅱ、、的表達(dá)情況手術(shù)組術(shù)后PKC、Ⅱ表達(dá)較術(shù)前無明顯變化(P0.05),PKC表達(dá)較術(shù)前減少(P(B.術(shù)前;A.術(shù)后)(B.術(shù)前;A.術(shù)后)圖5手術(shù)組PKC的表達(dá)圖6手術(shù)組PKC的表達(dá)(B.術(shù)前;A.術(shù)后)(B.術(shù)前;A.術(shù)后)53討論目前尚不清楚心肌細(xì)胞感受血流壓力變化的精確方式,以及由此引起的心肌相關(guān)信號(hào)通路活化及其在高血壓心肌肥厚過程中調(diào)節(jié)心肌基因的確切機(jī)制。

眾多生長因子的分離和分子克隆提示了不同亞型的生長因子和細(xì)胞因子在高血壓發(fā)病中的作用。

PKC是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵因子,它是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶,具有多種生理功能,細(xì)胞外信號(hào)通過膜上受體可將PKC啟動(dòng),進(jìn)而將底物蛋白磷酸化,以調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、離子轉(zhuǎn)運(yùn)和基因表達(dá)等重要活動(dòng)。

PKC至少有12種亞型或同工酶,這些亞型分布在不同組織中,可由不同的第一信使啟動(dòng)信息轉(zhuǎn)錄,各亞型的活化形式、活化程度、持續(xù)時(shí)間及細(xì)胞內(nèi)定位各不相同,在不同的組織中亞型表達(dá)各不一樣。

已有報(bào)道顯示,PKC啟動(dòng)后能使肌鈣蛋白I和T發(fā)生磷酸化,反射性抑制肌原纖維ATP酶活性,產(chǎn)生負(fù)性肌力作用,其次由于它能減少心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn),從而減弱心肌收縮力,持續(xù)啟動(dòng)的PKC與心肌細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)已被證實(shí)能夠啟動(dòng)心房利尿肽及2肌球蛋白基因,引起心肌肥厚。

然而不同的同功酶在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中起不同的作用,如PKC的啟動(dòng)可修飾Na+-K+-ATP酶,使其活性受抑制,且可以直接抑制細(xì)胞凋亡,與鈣調(diào)磷酸酶相互作用,調(diào)節(jié)組織對(duì)心肌缺血損害6的耐受性。

大量研究表明,PKC依賴的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)是心肌缺血預(yù)處理IPC中的重要環(huán)節(jié)。

目前認(rèn)為,并非所有的PKC亞型都參與了預(yù)處理時(shí)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。

已有研究用免疫熒光技術(shù)證實(shí)了PKC、、及在成年大鼠心肌細(xì)胞中存在及IPC時(shí)在心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)位。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),缺血預(yù)處理并沒有改變PKC、、在胞質(zhì)和胞膜中的比例;在冠狀動(dòng)脈阻斷/再灌注(O/R)后PKC在胞膜中的比例與O/R重復(fù)次數(shù)呈正相關(guān)。

而PKC、、、在胞膜中的比例升高則不明顯。

有目的地干擾PKC基因的表達(dá),可使心肌缺血預(yù)適應(yīng)梗死面積擴(kuò)大,心肌局部缺血過程中生理濃度的酒精消耗可激活PKC而對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用[3-4]。

Anita等[5]報(bào)道,PKC、Ⅱ通過ERK依賴的信號(hào)途徑參與VEGF的生成過程,由于VEGFmRNA及其蛋白表達(dá)上調(diào),從而導(dǎo)致伴隨PKC、Ⅱ和ERK活性增加。

本研究發(fā)現(xiàn),PKC、Ⅱ的表達(dá)在手術(shù)組手術(shù)前后無明顯變化,推測PKC、Ⅱ可能未直接參與高血壓的發(fā)病。

PKC為新型PKC,激活需要Ca2+參與,不被PKC的激活劑佛波酯激活,有關(guān)PKC的報(bào)道不多,高玖鳴等[6]發(fā)現(xiàn)PKC的轉(zhuǎn)基因過度表達(dá)未引起心臟負(fù)荷的加重。

本研究中PKC在手術(shù)組術(shù)后表達(dá)反而降低,考慮與高血壓發(fā)病相關(guān),然而其發(fā)病機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

筆者推測可能與其促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖有關(guān)。

7PKC是非典型PKC家族成員,作為PKC家族的新成員,由于它的一級(jí)結(jié)構(gòu)缺乏C2區(qū),且在其調(diào)節(jié)區(qū)只擁有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),因此,PKC顯示出與其他PKC明顯不同的特性,且廣泛參與細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[7]。

作為信息分子,PKC在多種細(xì)胞外刺激因素誘導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用,如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-B(nucleartranscriptionalfactor-B,NF-B)的活化和核糖體S6蛋白激酶通路等。

許多研究表明,PKC的激活機(jī)制具有組織細(xì)胞特異性[8]。

AngⅡ刺激使Ras與Raf結(jié)合增加,但PKC抑制劑并不影響Raf與Ras的結(jié)合,PKC通過Raf非依賴性途徑活化血管平滑肌細(xì)胞ERK1/2[9]。

本研究中,PKC在手術(shù)組術(shù)后無表達(dá)也支持這一點(diǎn),提示PKC在高血壓的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用,其表達(dá)下降可能是因ERK激活增加,從而導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖、血壓升高。

丁波等[10]報(bào)道,PKC能夠介導(dǎo)AngⅡ,激活Ca2+-鈣調(diào)節(jié)蛋白依賴性蛋白激酶,促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的增殖。

同時(shí)PKC的減少也對(duì)血管內(nèi)皮起到一定的保護(hù)作用,PKC通過VEGF參與了腎血管性高血壓大鼠的發(fā)病,在Ras和PI3激酶突變、缺失的情況下,活化的PKC明顯減少,Sp1與VEGF表達(dá)部分下調(diào)。

PKC在G蛋白耦聯(lián)受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用較清楚。

PKC的一種突變體能激活ERK和SAPK途徑,它的一種顯性負(fù)相(dominant8negative)突變體則抑制ERK的活化。

值得注意的是,很可能這兩種具有相反作用的突變體都參與了發(fā)病,PKC在功能上作為一種MEK激酶并應(yīng)答于AngⅡ誘導(dǎo)的ERK途徑的活化[11]。

PKC同工酶種類較多,其同工酶的組織分布、結(jié)構(gòu)、功能、活性以及基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制不同,并且與體內(nèi)多種病理生理過程的調(diào)節(jié)有關(guān)。

因此,開發(fā)PKC同工酶特異性拮抗劑,將會(huì)對(duì)多種疾病,尤其是在心腦血管疾病的治療中發(fā)揮重要作用[12]。

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