PKCα-βⅡ-η-ζ在腎血管性高血壓大鼠中表達

1/1PKCα-βⅡ-η-ζ在腎血管性高血壓大鼠中表達1PKC\Ⅱ\\在腎血管性高血壓大鼠中表達[摘要]目的:研究PKC、Ⅱ、、在腎血管性高血壓大鼠心肌中的表達,探討PKC亞型在高血壓發(fā)病機制中的作用。

方法:腎血管性高血壓大鼠模型制備成功后,提取部分心肌組織,采用WesternBlot測定PKC、Ⅱ、、的表達情況。

結(jié)果:PKC、Ⅱ、、表達在假手術(shù)組術(shù)前、術(shù)后無明顯變化;手術(shù)組PKC、Ⅱ表達較術(shù)前無明顯變化,PKC表達較術(shù)前減少,PKC術(shù)后無表達。

結(jié)論:PKC、Ⅱ可能未直接參與高血壓的發(fā)病。

PKC術(shù)后表達下降考慮與高血壓發(fā)病相關(guān),然而其發(fā)病機制尚需進一步探討,推測可能與其促進表皮細胞的增殖有關(guān)。

PKC作用于AngⅡ誘導(dǎo)的ERK途徑的活化,ERK激活增加,從而導(dǎo)致血管平滑肌細胞增殖,血壓升高。

PKC、在高血壓的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。

[關(guān)鍵詞]腎血管性高血壓大鼠;蛋白激酶C(PKC);細胞外信號調(diào)節(jié)激酶[中圖分類號]R-332[文獻標識碼]A[文章編號]1673-7210(2010)04(a)-027-03TheexpressionofproteinkinaseC,Ⅱ,,inratswithrenovascularhypertensionWANGHaixia,LIUShaokui,ZHANGDianlong2(TheAffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,China)[Abstract]Objective:ToinvestigatetheexpressionofproteinkinaseC(PKC),Ⅱ,andinratswithrenovascularhypertension,andtheeffectofsubtypesofPKConhypertensionwasalsoinvestigated.Methods:Renovascularhypertensionmodelsofratswereestablished.PKC,Ⅱ,andweredetectedincardiacmusclebyWesternBlot.Results:TheexpressionofPKC,Ⅱ,andofsham-operationgrouphadnoobviouschangebeforeandafteroperation.TheexpressionofPKCandⅡofoperationgroupafteroperationwerethesameasthatbeforeoperation,theexpressionofPKCafteroperationwasdecreased.PKCshowednoexpressionafteroperation.Conclusion:PKCandⅡmaydonotdirectlyparticipateintheeffectofhypertension.TheexpressiondecreasingofPKCafteroperationwouldberelatedtotheeffectofhypertension,itspathogenesyshouldbefurtherinvestigated.Itmayberelatedtotheproliferationofepidermiccells.PKCcanleadtovascularsmoothmusclecellproliferationandrisingofbloodpressurethroughERKactivationpathwayand3upregulationofERK,PKCandplayimportantrolesintheprocessoftheoccurrenceanddevelopmentofhypertension.[Keywords]Renovascularhypertensionmodelsofrats;ProteinkinaseC(PKC);Extracellularlyresponsivekinase(ERK)隨著生活水平的日益提高,高血壓的發(fā)病率逐年上升,由此引起的心衰更成為危害人類健康并致死的主要危險因素之一。

目前有關(guān)高血壓的研究很多,但其發(fā)病機制尚未完全闡明,有報道認為蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)各亞型在高血壓、心肌肥厚的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用[1]。

本文通過檢測高血壓大鼠模型心肌PKC、Ⅱ、、的表達情況,探討PKC亞型在高血壓發(fā)病機制中的作用。

1材料與方法1.1腎血管性高血壓大鼠模型的制備實驗選用42只正常血壓Wistar大鼠,均為雄性,體重165～180g,在大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心進行實驗(遼:scxk2002-0002;遼:syxk2002-0005)。

大鼠隨機分為正常對照組、手術(shù)組、假手術(shù)組。

模型制備:氯胺酮麻醉后備皮,取腹部正中切口開腹,分離后暴露一側(cè)腎動脈,針灸銀針緊貼在左腎動脈,用手術(shù)絲線將兩者一起結(jié)扎后,抽去銀針,逐層關(guān)腹,術(shù)后腹腔內(nèi)注射青霉素預(yù)防感染。

假手術(shù)組除不結(jié)扎腎動4脈外,其他手術(shù)步驟相同。

術(shù)后10周腎血管性高血壓大鼠模型成功建立[2],大鼠全部處死,取心肌組織,低溫液氮下保存。

1.2PKC、Ⅱ、、的提取和活性測定取部分心肌組織提取蛋白并定量,用聚丙烯酰胺變性凝膠分離蛋白(上樣量為40g總蛋白),將蛋白電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上,封閉后加一抗(1∶2000稀釋)、辣根過氧化物酶標記二抗(1∶1000稀釋),用化學(xué)發(fā)光試劑NCIP/BCIP顯影,X線片壓片曝光,凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果,重復(fù)3次(全部一抗、二抗試劑來自SantaCruzBiotechnology)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)以SPSS10.0軟件處理,組間進行t檢驗,P0.05)。

見圖1、2。

2.2手術(shù)組PKC、Ⅱ、、的表達情況手術(shù)組術(shù)后PKC、Ⅱ表達較術(shù)前無明顯變化(P0.05),PKC表達較術(shù)前減少(P(B.術(shù)前;A.術(shù)后)(B.術(shù)前;A.術(shù)后)圖5手術(shù)組PKC的表達圖6手術(shù)組PKC的表達(B.術(shù)前;A.術(shù)后)(B.術(shù)前;A.術(shù)后)53討論目前尚不清楚心肌細胞感受血流壓力變化的精確方式,以及由此引起的心肌相關(guān)信號通路活化及其在高血壓心肌肥厚過程中調(diào)節(jié)心肌基因的確切機制。

眾多生長因子的分離和分子克隆提示了不同亞型的生長因子和細胞因子在高血壓發(fā)病中的作用。

PKC是細胞內(nèi)一條重要的信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵因子,它是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶,具有多種生理功能,細胞外信號通過膜上受體可將PKC啟動,進而將底物蛋白磷酸化,以調(diào)控細胞的增殖、分化、離子轉(zhuǎn)運和基因表達等重要活動。

PKC至少有12種亞型或同工酶,這些亞型分布在不同組織中,可由不同的第一信使啟動信息轉(zhuǎn)錄,各亞型的活化形式、活化程度、持續(xù)時間及細胞內(nèi)定位各不相同,在不同的組織中亞型表達各不一樣。

已有報道顯示,PKC啟動后能使肌鈣蛋白I和T發(fā)生磷酸化,反射性抑制肌原纖維ATP酶活性,產(chǎn)生負性肌力作用,其次由于它能減少心肌細胞肌漿網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運,從而減弱心肌收縮力,持續(xù)啟動的PKC與心肌細胞之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)已被證實能夠啟動心房利尿肽及2肌球蛋白基因,引起心肌肥厚。

然而不同的同功酶在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制中起不同的作用,如PKC的啟動可修飾Na+-K+-ATP酶,使其活性受抑制,且可以直接抑制細胞凋亡,與鈣調(diào)磷酸酶相互作用,調(diào)節(jié)組織對心肌缺血損害6的耐受性。

大量研究表明,PKC依賴的細胞信號傳導(dǎo)是心肌缺血預(yù)處理IPC中的重要環(huán)節(jié)。

目前認為,并非所有的PKC亞型都參與了預(yù)處理時的細胞信號傳導(dǎo)。

已有研究用免疫熒光技術(shù)證實了PKC、、及在成年大鼠心肌細胞中存在及IPC時在心肌細胞的轉(zhuǎn)位。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),缺血預(yù)處理并沒有改變PKC、、在胞質(zhì)和胞膜中的比例;在冠狀動脈阻斷/再灌注(O/R)后PKC在胞膜中的比例與O/R重復(fù)次數(shù)呈正相關(guān)。

而PKC、、、在胞膜中的比例升高則不明顯。

有目的地干擾PKC基因的表達,可使心肌缺血預(yù)適應(yīng)梗死面積擴大,心肌局部缺血過程中生理濃度的酒精消耗可激活PKC而對心肌產(chǎn)生保護作用[3-4]。

Anita等[5]報道,PKC、Ⅱ通過ERK依賴的信號途徑參與VEGF的生成過程,由于VEGFmRNA及其蛋白表達上調(diào),從而導(dǎo)致伴隨PKC、Ⅱ和ERK活性增加。

本研究發(fā)現(xiàn),PKC、Ⅱ的表達在手術(shù)組手術(shù)前后無明顯變化,推測PKC、Ⅱ可能未直接參與高血壓的發(fā)病。

PKC為新型PKC,激活需要Ca2+參與,不被PKC的激活劑佛波酯激活,有關(guān)PKC的報道不多,高玖鳴等[6]發(fā)現(xiàn)PKC的轉(zhuǎn)基因過度表達未引起心臟負荷的加重。

本研究中PKC在手術(shù)組術(shù)后表達反而降低,考慮與高血壓發(fā)病相關(guān),然而其發(fā)病機制尚需進一步探討。

筆者推測可能與其促進表皮細胞的增殖有關(guān)。

7PKC是非典型PKC家族成員,作為PKC家族的新成員,由于它的一級結(jié)構(gòu)缺乏C2區(qū),且在其調(diào)節(jié)區(qū)只擁有一個鋅指結(jié)構(gòu),因此,PKC顯示出與其他PKC明顯不同的特性,且廣泛參與細胞功能的調(diào)節(jié)[7]。

作為信息分子,PKC在多種細胞外刺激因素誘導(dǎo)的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用,如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-B(nucleartranscriptionalfactor-B,NF-B)的活化和核糖體S6蛋白激酶通路等。

許多研究表明,PKC的激活機制具有組織細胞特異性[8]。

AngⅡ刺激使Ras與Raf結(jié)合增加,但PKC抑制劑并不影響Raf與Ras的結(jié)合,PKC通過Raf非依賴性途徑活化血管平滑肌細胞ERK1/2[9]。

本研究中,PKC在手術(shù)組術(shù)后無表達也支持這一點,提示PKC在高血壓的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用,其表達下降可能是因ERK激活增加,從而導(dǎo)致血管平滑肌細胞增殖、血壓升高。

丁波等[10]報道,PKC能夠介導(dǎo)AngⅡ,激活Ca2+-鈣調(diào)節(jié)蛋白依賴性蛋白激酶,促進心肌成纖維細胞的增殖。

同時PKC的減少也對血管內(nèi)皮起到一定的保護作用,PKC通過VEGF參與了腎血管性高血壓大鼠的發(fā)病,在Ras和PI3激酶突變、缺失的情況下,活化的PKC明顯減少,Sp1與VEGF表達部分下調(diào)。

PKC在G蛋白耦聯(lián)受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用較清楚。

PKC的一種突變體能激活ERK和SAPK途徑,它的一種顯性負相(dominant8negative)突變體則抑制ERK的活化。

值得注意的是,很可能這兩種具有相反作用的突變體都參與了發(fā)病,PKC在功能上作為一種MEK激酶并應(yīng)答于AngⅡ誘導(dǎo)的ERK途徑的活化[11]。

PKC同工酶種類較多,其同工酶的組織分布、結(jié)構(gòu)、功能、活性以及基因表達的調(diào)節(jié)機制不同,并且與體內(nèi)多種病理生理過程的調(diào)節(jié)有關(guān)。

因此,開發(fā)PKC同工酶特異性拮抗劑,將會對多種疾病,尤其是在心腦血管疾病的治療中發(fā)揮重要作用[12]。

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