不同時(shí)間脾切除聯(lián)用環(huán)孢素對(duì)協(xié)調(diào)性異種心臟移植物存活的影響

1/1不同時(shí)間脾切除聯(lián)用環(huán)孢素對(duì)協(xié)調(diào)性異種心臟移植物存活的影響不同時(shí)間脾切除聯(lián)用環(huán)孢素對(duì)協(xié)調(diào)性異種心臟移植物存活的影響不同時(shí)間脾切除聯(lián)用環(huán)孢素對(duì)協(xié)調(diào)性異種心臟移植物存活的影響作者：

王博，呂毅，張曉剛，李暉，仵正，潘承恩【摘要】目的探討脾切除聯(lián)用環(huán)孢素對(duì)協(xié)調(diào)性異種移植心臟存活時(shí)間的影響及其機(jī)制。

方法建立協(xié)調(diào)性異種心臟移植模型。

分別采用不同時(shí)間脾切除聯(lián)用環(huán)孢素，觀察異種移植物的生存時(shí)間。

用CH50法檢測各組動(dòng)物血清中總補(bǔ)體活性。

應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測動(dòng)物血清中異種反應(yīng)性抗體IgG、IgM的滴度變化。

移植物標(biāo)本HE染色觀察病頑理學(xué)改變。

免疫組化染色觀察各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間移植物組織中IgG、IgM抗體箜的沉積。

結(jié)果脾切除聯(lián)用環(huán)孢素能夠顯著作延長移植物的生存時(shí)間(P【關(guān)鍵詞】茼異種移植；環(huán)孢素；心臟移植同種異體被器官移植成為終末期腎臟、心臟、肝臟等ィ疾病的常規(guī)治療手段，已經(jīng)為越來越多的顥患者所接受。

但是，人類供體器官缺乏一直困擾著器官移植的發(fā)展。

用合適的動(dòng)物％作為器官供體，可能成為解決器官缺乏的波有效手段之一。

自20世紀(jì)60年代起，ㄏ人們用非人類器官進(jìn)行異種移植的嘗試以赭來，已經(jīng)進(jìn)行了腎、心、肝臟等器官異種倒移植。

但是，異種移植的免疫排斥反應(yīng)較喋同種移植更為強(qiáng)烈。

協(xié)調(diào)性異種移植(c筅oncordantxenotrans肼plantation)中，移植物雖不芑發(fā)生超急性排斥反應(yīng)，但是在移植術(shù)后3傾-4d內(nèi)將會(huì)發(fā)生急性血管排斥反應(yīng)(acutevascularrejection,AVR)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，誘ゼ生型異種反應(yīng)性抗體(elicited籟xenotractiveantibody,EXA)在AVR中起到重要作用暌。

EXA結(jié)合于移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞上，鎰激活補(bǔ)體、活化血管內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生一系傴列黏附分子和前炎癥細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致烷移植物被排斥[1]。

因此，通過調(diào)節(jié)移猁植術(shù)后早期EXA的產(chǎn)生可能延緩或減輕塾排斥反應(yīng)的發(fā)生。

本試驗(yàn)中，我們將通過嫁不同時(shí)間脾切除聯(lián)用環(huán)孢素對(duì)受者進(jìn)行干俱預(yù)，觀察異種移植物在受者體內(nèi)的存活情況，初步探討異種反應(yīng)性抗體在異種排斥示反應(yīng)中的作用。

1材料與方法動(dòng)讒物與分組供體為健康成年金黃地鼠7蝴0只，80-100g，雌雄不拘。

受體項(xiàng)SD大鼠70只，180-200g，均雖購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

咽采用雙套入法建立金黃地鼠對(duì)SD大加鼠協(xié)調(diào)性異種心臟移植模型。

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物煢隨機(jī)分為6組：

對(duì)照組(n＝10)，不蜴予任何治療措施；環(huán)孢素組(n=10)鸞，移植當(dāng)日起每日腹腔注射環(huán)孢素10m癰g/kg；脾切除組(n＝10)，移植枋心臟復(fù)跳后即予以脾切除；D0脾切除＋笪CsA組(n＝15)，移植心臟復(fù)跳后嬤即予以脾切除，每日腹腔注射環(huán)孢素10mg/kg；D1脾切除＋CsA組(n店＝15)，移植術(shù)后1d予以脾切除，每拱日腹腔注射環(huán)孢素10mg/kg；D3抵脾切除＋CsA組(n=10)，移植術(shù)后3d予以脾切除，每日腹腔注射環(huán)孢素狙10mg/kg。

術(shù)后處理與觀察每組隨機(jī)選取5例實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察移植心臟嘌存活時(shí)間。

移植心臟復(fù)跳至停跳的時(shí)間為軒異種移植物存活時(shí)間[2]。

移植心臟存莢活時(shí)間大于30d認(rèn)為長期存活。

移植物磲在3d內(nèi)停跳，視為手術(shù)失敗。

血清鍇標(biāo)本與組織標(biāo)本的采集分別于移植術(shù)貽后1、2、3、7、14、30d剖殺動(dòng)蕨物取血清、移植心臟標(biāo)本，將血清標(biāo)本保唬存在-20℃低溫冰箱中，以備檢測血清侵中補(bǔ)體活性和異種反應(yīng)性抗體IgG、IヱgM的滴度。

取供體心臟組織進(jìn)行HE染放色的組織病理學(xué)檢測。

CH50實(shí)驗(yàn)產(chǎn)檢測各實(shí)驗(yàn)組血清補(bǔ)體溶血活性配制薔2%(體積分?jǐn)?shù))綿羊紅細(xì)胞懸液。

各實(shí)槲驗(yàn)組血清、正常大鼠血清(對(duì)照)稀釋2瘢0倍。

用生理鹽水將溶血素稀釋為2u/藜mL。

在各管中分別加入試劑和反應(yīng)物，銓放入37℃水浴箱中溫浴30min。

選擇溶血程度與標(biāo)準(zhǔn)管相近的兩管在分光光猸度計(jì)上，540nm波長條件下，測量讀取吸光度A值。

每毫升血清總補(bǔ)體活性(４單位)＝1/血清用量稀釋倍數(shù)。

異種反應(yīng)性抗體IgG、IgM的測定た應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)測定對(duì)照組、D1脾藁切除＋CsA組、D3脾切除＋CsA組羋大鼠血清中異種反應(yīng)性IgG、IgM抗聳體[3]。

采用CellQuest軟件的分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中遺所含異種反應(yīng)性IgG、IgM抗體相對(duì)木滴度應(yīng)用下列公式表示：

異種反應(yīng)性Ig膜G、IgM抗體相對(duì)滴度＝各實(shí)驗(yàn)組血清菡平均熒光強(qiáng)度/正常大鼠血清平均熒光強(qiáng)捋度。

免疫組化染色檢測各實(shí)驗(yàn)組移植櫪物組織中異種反應(yīng)性抗體IgM、IgG毒的沉積石蠟切片脫蠟至水，3%(體貰積分?jǐn)?shù))H2O2室溫下孵育20min焦。

微波抗原修復(fù)，10%(體積分?jǐn)?shù))山羊血清封閉。

滴加一抗，抗體稀釋度為1蹼∶50，置冰箱4℃過夜。

加聚合物增強(qiáng)餐劑50-100L，在37℃反應(yīng)20min后，每張切片滴加DAB顯色液。

移植物組織中IgG、IgM沉積時(shí)陽性痊表達(dá)的判定：

移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞表面和組織中可見棕黃色顆粒樣物質(zhì)沉積。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差株(s)表示，軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P厭2結(jié)果移植心臟存活時(shí)間脾切詼除組、D0脾切除＋CsA組、D1脾切笞除＋CsA組、D3脾切除＋CsA組移配植物存活時(shí)間明顯較對(duì)照組延長。

環(huán)孢素翊組移植物生存時(shí)間與對(duì)照組無顯著性差異ぇ。

各實(shí)驗(yàn)組移植心臟存活時(shí)間見表1。

表音1不同組異種移植物的存活時(shí)間移榍植物的病理學(xué)改變對(duì)照組、環(huán)孢素組亦、脾切除組、D3脾切除+CsA組移植眈心臟發(fā)生排斥反應(yīng)時(shí)，光鏡下可見廣泛血坳管內(nèi)血栓形成伴心肌組織間大量的出血。

章心肌組織中大量的單個(gè)核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞畬浸潤(圖1A)。

D0脾切除+CsA組７、D1脾切除+CsA組移植術(shù)后第14天時(shí)，心臟組織中可見炎細(xì)胞浸潤，無明能顯出血、血栓形成。

移植術(shù)后第30天時(shí)，可見少量微血栓形成，未見明顯組織出⑦血，組織間有少量單個(gè)核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞ｄ浸潤(圖1B)。

各組不同時(shí)間CH綈50值的變化正常SD大鼠血清總補(bǔ)む體活性為()u/mL(正常參考值范釘圍為50-100u/mL)。

本實(shí)驗(yàn)中瀆，對(duì)照組、環(huán)孢素組、脾切除組、D3脾切除+CsA組受體體內(nèi)總補(bǔ)體活性在術(shù)鼯后明顯下降，提示受者體內(nèi)大量補(bǔ)體活化帝。

D0脾切除+CsA組和D1脾切除+旃CsA組受體血清CH50值在移植術(shù)后胬處于正常范圍內(nèi)。

異種反應(yīng)性抗體I♂gG、IgM在移植心臟組織中的沉積對(duì)照組、環(huán)孢素組、脾切除組、D3脾餃切除+CsA組，移植心臟發(fā)生排斥反應(yīng)時(shí)，組織中可見大量IgG、IgM沉積ㄈ于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面(圖1C-D)。

D雀0脾切除＋CsA組和D1脾切除+Cs刪A組長期存活(生存時(shí)間大于30d)的櫛移植心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞表面可見異種反應(yīng)ぁ性抗體的沉積(圖1E-F)。

各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物體內(nèi)抗異種反應(yīng)性抗體的變化對(duì)照組、D1脾切除＋CsA組、D3脾璺切除+CsA組大鼠血清中異種反應(yīng)性I烙gM、IgG抗體的變化(圖2-4)。

碟3討論在協(xié)調(diào)性異種移植時(shí)，異種Ｄ抗原刺激受者免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生較高水平的誘生型異種反應(yīng)性抗體(elicit嗆edxenotractiveantibody,EXA)[47]，抗體結(jié)合于異種移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，激活縉補(bǔ)體、活化內(nèi)皮細(xì)胞[8]，繼而導(dǎo)致排牙斥反應(yīng)的發(fā)生。

排斥反應(yīng)的發(fā)生與EXA灼IgM、EXAIgG關(guān)系密切[9]。

旄EXAIgG的產(chǎn)生是T細(xì)胞依賴性的。

逾這類抗體的產(chǎn)生可以被環(huán)孢素等T細(xì)胞免鞘疫抑制劑所抑制。

EXAIgM的產(chǎn)生是男T細(xì)胞非依賴性的，其產(chǎn)生不受環(huán)孢素等謹(jǐn)T細(xì)胞免疫抑制劑的影響。

異種移植中，脾臟是產(chǎn)生T細(xì)胞非依賴性抗體和B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)的重要器官[1镅0]。

脾臟的超微結(jié)構(gòu)有利于抗原識(shí)別和踔抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生[11]。

有萼研究表明，產(chǎn)生異種抗體的B淋巴細(xì)胞主倦要存在于大鼠脾臟內(nèi)[1214]。

因此，我們推測可以通過脾切除來抑制受者齜體內(nèi)異種反應(yīng)性抗體的產(chǎn)生，從而延緩異玉種移植的急性血管排斥反應(yīng)的發(fā)生。

本試郊驗(yàn)中，我們通過不同時(shí)間脾切除聯(lián)用環(huán)孢詆素，觀察移植物在受者體內(nèi)的生存時(shí)間。

鄢環(huán)孢素組移植物生存時(shí)間與對(duì)照組間無顯凜著性差異，提示EXAIgM在急性血管墀排斥反應(yīng)中起到重要作用。

脾切除組移植物生存時(shí)間較對(duì)照組延長2-3d，但不能使異種移植物長期存活。

證實(shí)協(xié)調(diào)性異撞種移植時(shí)，EXAIgG也參與了急性血嶄管排斥反應(yīng)。

手術(shù)當(dāng)天和術(shù)后第1天脾切啕除聯(lián)用環(huán)孢素后，異種移植物能夠在受者系體內(nèi)長期存活。

CH50實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照組Ｃ、環(huán)孢素組、脾切除組、D3脾切除+C間sA組受者體內(nèi)的總補(bǔ)體活性逐漸升高，直至發(fā)生排斥反應(yīng)。

然而，D0脾切除+龕CsA組和D1脾切除+CsA組受者體薇內(nèi)總補(bǔ)體活性始終處于正常范圍內(nèi)。

通過訕檢測受者體內(nèi)異種反應(yīng)性抗體滴度后發(fā)現(xiàn)詢：

盡管D1脾切除+CsA組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體繆內(nèi)存在一定量的異種反應(yīng)性抗體，但其一旺直處于低水平。

這與移植術(shù)后早期脾切除幀聯(lián)用環(huán)孢素有關(guān)。

其可能原因是：

低水平的異種反應(yīng)性抗體不足以激活補(bǔ)體。

隨著掏移植時(shí)間的延長，受者體內(nèi)的異種反應(yīng)性酎抗體雖然有升高趨勢，但移植物仍然沒有ァ被排斥。

這可能與移植物本身發(fā)生的一系列改變有密切關(guān)系，即低濃度的抗體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的持續(xù)性刺激導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷的敏感性下降[1516]。

D3脾切腸除+CsA組由于在移植術(shù)后第3天進(jìn)行暌脾切除，不能在早期抑制EXAIgM的撅產(chǎn)生。

因此，移植物不能長期存活。

綜上所述，通過抑制移植術(shù)后早期受者體內(nèi)異趼種反應(yīng)性抗體的產(chǎn)生使其處于較低水平，總可以顯著延長異種移植物的生存時(shí)間，有棋利于減少排斥反應(yīng)的發(fā)生。

【參考文獻(xiàn)綠】\[1\]SaadiS,Pla芪ttJL.Humoralreject㈨ionandendothelialcellactivation\[J\]砸.Xenotransplantati郊o(jì)n,2002,9(4):2392層41.\[2\]TabataT,d破ePerrotM,Keshavjee勞S,etal.Accommodati癡onafterlungxenogra椋ftingfromhamstertorat\[J\].Transplantation,XX,75(5):60桔7612.\[3\]WangN,Lee,TobiaschE,etal狀.Inductionofxnoegr郵aftaccommodationby輕modulationofelicit】edantibodyresponses\[J\].Transplanta諦tion,2002,74(3):334345.\[4\]Brouar搡dS,BouhoursD,Sebil腕leF,etal.Induction廁ofantiforssmanant囈ibodiesinthehamste泛rtoratxenotransp拆lantationmodels\[J靛\].Transplantation,2000,69(6):11931共201.\[5\]LinY,Soa笸resMP,SatoK,etal.L撬ongtermsurvivalof邢hamsterheartsinpre冠sensitizedrats\[J\旮].JImmunol,2000,16鐸4(9):48834892.\[丕6\]MiyatakeT,SatoK謊,TakigamiK,etal.Co虔mplementfixingelic於itedantibodiesarea弗majorcomponentinth荬epathogenesisofxen例ograftrejection\[J震\].JImmunol,1998,1迅60(8):41144123.\睡[7\]KoyamadaN,Miya螨takeT,CandinasD,et芨al.Transientcomple羞mentinhibitinplusT庖cellimmunosuppres騙sioninducelongtermsurvivalofmouset仄oratcardiacxenogr笞afts\[J\].Transpla╅ntation,1998,65(9)⒘:12101215.\[8\]SaadiS,TakahashiT,H虬olzknechtRA,etal.P榍athwaystoacutehumo嫡ralrejection\[J\].AmJPathol,XX,164(3サ):10731080.\[9\]┆SatoK,TakigamiK,Mi蘢yatakeK,etal.SupprЁessionofdelayedrejectionbyspecificde飄pletionofeliciteda鄂ntibodiesoftheIgMi刺sotype\[J\].Transp顳lantation,1999,68(ㄩ6):844854.\[10\]淳CarobbiA,AranedaD,篪ThomasF,etal.Splen酤ectomyisapotentimm鳳unosuppressivemodalityforcardiacxenografting\[J\].Tran萵splantProc,1993,25檀(1):419420.\[11\畬]FuYX,ChaplinDD.De堅(jiān)velopmentandmatura怦tionofsecondlympho坭idtissues\[J\].Ann亥uRevImmunol,1999,1帆7(2):399433.\[12\]VandenEertweghA,覯BoersmaW,ClaassenE,etal.Immunologica長lfunctionsandinvivocellcellinteract豢ionsofTcellsinthes跏pleen\[J\].CritRev┊Immunol,1992,11(6)檣:337342.\[13\]Mi輦yazawaH,MuraseN,De邋metrisA,etal.