氨基酸紙層析糖旋光度的測定a

1、實驗五實驗五氨基酸的紙層析氨基酸的紙層析糖旋光度的測定糖旋光度的測定1.學習層析（色譜）分離技術。學習層析（色譜）分離技術。2.學習旋光度測定技術。學習旋光度測定技術。實驗目的：實驗目的：一、氨基酸的紙色譜一、氨基酸的紙色譜 色譜法：色譜法：根據(jù)不同根據(jù)不同溶質溶質在在固定相固定相和和流動相流動相之間的作用力之間的作用力（分配、吸附、離子交換等）的差別，在隨著流動相經過固（分配、吸附、離子交換等）的差別，在隨著流動相經過固定相時，在兩相之間形成多次平衡，被流動相帶動移動的速定相時，在兩相之間形成多次平衡，被流動相帶動移動的速度不同，達到分離效果的方法。度不同，達到分離效果的方法。固定相固定相：

2、固定不動，對樣品產生保留作用的物質。：固定不動，對樣品產生保留作用的物質。流動相流動相：帶動樣品，經過固定相的物質。：帶動樣品，經過固定相的物質。色譜過程的實質：是樣品在固定相中吸附與解析的過程。色譜過程的實質：是樣品在固定相中吸附與解析的過程。按按分離機制分離機制，可分為：，可分為：吸附色譜：吸附色譜：分子在兩相中吸附性能不同，進行分離分子在兩相中吸附性能不同，進行分離分配色譜：分配色譜：分子在兩相中分配系數(shù)不同，進行分離分子在兩相中分配系數(shù)不同，進行分離離子交換色譜：離子交換色譜：分子在兩相中離子交換性能不同，進行分離分子在兩相中離子交換性能不同，進行分離體積排阻色譜：體積排阻色譜：體積大

3、的留在固定相的小孔內，體積小的先體積大的留在固定相的小孔內，體積小的先 流出。流出。親和色譜：親和色譜：分子在兩相中親和力不同，進行分離。分子在兩相中親和力不同，進行分離。電泳色譜、電色譜：電泳色譜、電色譜：離子在電場中移動的速度不同進行分離離子在電場中移動的速度不同進行分離色譜法分類色譜法分類按按操作方式操作方式不同，又可分為：不同，又可分為：柱色譜柱色譜氣相色譜氣相色譜高效液相色譜高效液相色譜薄層色譜薄層色譜紙色譜紙色譜等等固定相固定相組分組分紙色譜：紙色譜：為為分配色譜分配色譜，濾紙為載體，固定相為濾紙上的水分，濾紙為載體，固定相為濾紙上的水分，流動相（展開劑）為用水飽和過的有機溶劑。流

4、動相（展開劑）為用水飽和過的有機溶劑。操作技術：上行法、下行法、環(huán)行法操作技術：上行法、下行法、環(huán)行法紙色譜、薄層色譜的一般操作步驟紙色譜、薄層色譜的一般操作步驟1.制板（紙）制板（紙）將一個將一個1.5cm 長、長、1cm 寬的濾紙，剪成扇子狀，并卷寬的濾紙，剪成扇子狀，并卷起來起來濾紙芯兒的制作濾紙芯兒的制作在濾紙中央，用鉛筆畫一個半徑在濾紙中央，用鉛筆畫一個半徑0.5cm的圓圈（直徑一角硬的圓圈（直徑一角硬幣大?。糯笮。Ｔ趫A圈中心扎一個孔，插入準備好的濾紙芯兒。在圓圈中心扎一個孔，插入準備好的濾紙芯兒。插入時，濾紙芯的扇花部分插進濾紙孔一小部分，以蓋到培插入時，濾紙芯的扇花部分插進

5、濾紙孔一小部分，以蓋到培養(yǎng)皿上方時不碰到液體為準。養(yǎng)皿上方時不碰到液體為準。2.點樣點樣毛細管點樣：毛細管與板（紙）垂直，毛細管點樣：毛細管與板（紙）垂直，點樣位置、點樣距離：不被展開劑浸泡、以顯色后點之間易分開為準。點樣位置、點樣距離：不被展開劑浸泡、以顯色后點之間易分開為準。點樣量、樣品濃度：輕輕點一次即可。點樣量、樣品濃度：輕輕點一次即可。本次實驗：點三個樣品本次實驗：點三個樣品兩個標準樣品，一個混合樣品兩個標準樣品，一個混合樣品3.展開展開將薄層板斜放入層析缸中（或將濾紙掛在層析缸中），層析缸中流將薄層板斜放入層析缸中（或將濾紙掛在層析缸中），層析缸中流動相（展開劑）的量以不浸泡樣點為

6、宜。有些層析缸如下圖，易進動相（展開劑）的量以不浸泡樣點為宜。有些層析缸如下圖，易進行先飽和后展開操作，提高重現(xiàn)性和避免邊緣現(xiàn)象。行先飽和后展開操作，提高重現(xiàn)性和避免邊緣現(xiàn)象。邊緣現(xiàn)象：兩邊高邊緣現(xiàn)象：兩邊高本次紙色譜實驗展開步驟：本次紙色譜實驗展開步驟：1.在培養(yǎng)皿中加入適量展開劑在培養(yǎng)皿中加入適量展開劑2.把點好樣的濾紙放到培養(yǎng)皿上，注意濾紙芯兒不能碰展開劑。蓋上培把點好樣的濾紙放到培養(yǎng)皿上，注意濾紙芯兒不能碰展開劑。蓋上培養(yǎng)皿養(yǎng)皿飽和飽和510分鐘。分鐘。3.把濾紙芯兒壓下去，使濾紙芯兒的另一端稍微扇開，并接觸展開劑，把濾紙芯兒壓下去，使濾紙芯兒的另一端稍微扇開，并接觸展開劑，開始展開。

7、開始展開。4.當流動相（展開劑）的前沿到達濾紙邊當流動相（展開劑）的前沿到達濾紙邊1cm左右時，停止展開，立即取左右時，停止展開，立即取出濾紙，用鉛筆畫出展開劑前沿線。出濾紙，用鉛筆畫出展開劑前沿線。5.去溶劑：烘干去溶劑：烘干展開劑前沿線展開劑前沿線飽和飽和展開展開畫出展開劑前沿畫出展開劑前沿4.顯色顯色可見光下觀察可見光下觀察紫外燈下觀察紫外燈下觀察顯色劑顯色：顯色劑顯色：通用：通用：10% 硫酸乙醇溶液；碘蒸氣；硫酸乙醇溶液；碘蒸氣； 大部分有機樣品：磷鉬酸大部分有機樣品：磷鉬酸/乙醇溶液乙醇溶液專用：專用： 碘化鉍鉀碘化鉍鉀 生物堿；生物堿； 三氯化鐵三氯化鐵 黃酮；黃酮； 茚三酮茚三

8、酮 氨基酸氨基酸 顯色操作：將茚三酮噴至濾紙潤濕，不易流淌顯色操作：將茚三酮噴至濾紙潤濕，不易流淌5.計算比移值計算比移值rf f 值的意義：值的意義：定性分析的指標定性分析的指標評價展開劑選擇是否合適、評價分離效果評價展開劑選擇是否合適、評價分離效果 薄層層析：薄層層析：rf f 0.300.80， rf 0.05 紙紙 層層 析：析：rf f 0.050.85， rf 0.052、影響旋光度的因素、影響旋光度的因素測定波長、濃度、測定管長度、溶劑、溫度測定波長、濃度、測定管長度、溶劑、溫度比旋光度比旋光度：旋光管長度，：旋光管長度，dm 1）按通電源，預熱約）按通電源，預熱約5min2）零

9、點誤差校正）零點誤差校正選定并選定并清洗清洗測定管：用水洗（留意密封墊和玻璃透光片，測定管：用水洗（留意密封墊和玻璃透光片，不要寧得太緊，否則讀數(shù)不準）不要寧得太緊，否則讀數(shù)不準）裝入水：排氣泡，旋上螺蓋（不易過緊）裝入水：排氣泡，旋上螺蓋（不易過緊）放入樣品管槽：玻璃泡部位在上部放入樣品管槽：玻璃泡部位在上部調零點視野確定零點誤差：數(shù)值與誤差方向調零點視野確定零點誤差：數(shù)值與誤差方向檢查旋光儀零位是否準確，即在旋光儀未放試管或放進檢查旋光儀零位是否準確，即在旋光儀未放試管或放進充滿蒸餾水的試管時，觀察零度時視場亮度是否一致。充滿蒸餾水的試管時，觀察零度時視場亮度是否一致。如不一致，說明有零位

10、誤差，應在測量讀數(shù)中減去或加如不一致，說明有零位誤差，應在測量讀數(shù)中減去或加上該偏差值。上該偏差值。 4、旋光儀的使用和旋光度的測定方法、旋光儀的使用和旋光度的測定方法測定旋光讀數(shù)：測定旋光讀數(shù)：轉動度盤、檢偏鏡、在視場中覓得亮度一轉動度盤、檢偏鏡、在視場中覓得亮度一致且致且暗暗的位置，再從度盤上讀數(shù)。讀數(shù)是正（順時針方向旋的位置，再從度盤上讀數(shù)。讀數(shù)是正（順時針方向旋轉）的為右旋物質，讀數(shù)是負（逆時針方向旋轉）的為左旋轉）的為右旋物質，讀數(shù)是負（逆時針方向旋轉）的為左旋物質。物質。 讀數(shù)方法：讀數(shù)方法：主尺分主尺分180格，每格格，每格1；游標尺分；游標尺分10格，每大格格，每大格0.1 ，

11、每小格，每小格0.05 。1.先看游標尺先看游標尺0刻度線指向主尺的哪兩個數(shù)之間：圖中刻度線指向主尺的哪兩個數(shù)之間：圖中9和和10 之間之間 則旋光度為則旋光度為9.x2.看游標尺刻度線與主尺刻度線重合的位置：圖中游標尺的看游標尺刻度線與主尺刻度線重合的位置：圖中游標尺的3 則代表則代表0.30因此該物質旋光度為因此該物質旋光度為 右旋右旋9.30 1主尺逆時針旋轉：左旋主尺逆時針旋轉：左旋0刻度線，也是180度線刻度：刻度： (+)179.30 (-)0.70右旋右旋右旋右旋左旋左旋左旋左旋+30，-150 可以說刻度是右旋可以說刻度是右旋30度，或左旋度，或左旋150度度實際旋光度是多少，

12、再稀釋一半物質后測定，是實際旋光度是多少，再稀釋一半物質后測定，是15度，表明就是右旋的度，表明就是右旋的（3）已知濃度的葡萄糖的測定：）已知濃度的葡萄糖的測定：試樣管潤洗、裝入試樣管潤洗、裝入10%葡萄糖溶液（葡萄糖溶液（0.1g/ml)，調零點視場并讀數(shù)。，調零點視場并讀數(shù)。（4）稀釋葡萄糖的測定，確定旋光方向：）稀釋葡萄糖的測定，確定旋光方向：取出樣品管，加入葡萄糖的稀釋溶液，調零點視場并讀數(shù)。取出樣品管，加入葡萄糖的稀釋溶液，調零點視場并讀數(shù)。（5）未知濃度的葡萄糖的測定：）未知濃度的葡萄糖的測定：取出樣品管，加入不知濃度的葡萄糖溶液，調零點視場并讀數(shù)。取出樣品管，加入不知濃度的葡萄糖溶液，調零點視場并讀數(shù)。（6）結果處理：）結果處理：扣除零點誤差：同方向減，異方向加?？鄢泓c誤差：同方向減，異方向加。由已知樣算出比旋光度，再