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文檔簡(jiǎn)介
1/1阿米洛利對(duì)大鼠膀胱ICCs細(xì)胞內(nèi)Ca2波動(dòng)的影響研究阿米洛利對(duì)大鼠膀胱ICCs細(xì)胞內(nèi)Ca2+波動(dòng)的影響研究1湖北省十堰市人民醫(yī)院湖北省十堰市4420002昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院云南昆明650032本研究受云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究資助,項(xiàng)目編號(hào):
2014FB042作者簡(jiǎn)介:
王天寶(1985-),男,碩士,十堰市人民醫(yī)院。
通訊作者:
劉孝東,碩士生導(dǎo)師,副教授,昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院。
【摘要】目的:
探討鹽酸阿米洛利對(duì)膀胱cajal樣間質(zhì)細(xì)胞(interstitialcellsofCajal,ICCs)細(xì)胞內(nèi)Ca2+波動(dòng)的影響。
方法:
體外分離并培養(yǎng)SD大鼠膀胱ICCs細(xì)胞,膀胱ICCs細(xì)胞爬片成功后,將待實(shí)驗(yàn)細(xì)胞爬片分為:
50mu;mol/L和100mu;mol/L的阿米洛利溶液孵育組、空白對(duì)照組采取PBS溶液孵育。
在顯微鏡下隨機(jī)選取20個(gè)與周圍細(xì)胞無(wú)接觸、孤立存在的膀胱ICCs細(xì)胞,采用Fluo-3-AM孵育后在激光掃描共聚焦顯微鏡下檢測(cè)各組膀胱ICCs細(xì)胞內(nèi)Ca2+波動(dòng)情況。
結(jié)果:50mu;mol/L阿米洛利處理組,膀胱ICCs細(xì)胞內(nèi)Ca2+波動(dòng)較孵育前有所頻率減慢但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但Ca2+波動(dòng)振幅明顯較前變小,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01);100mu;mol/L阿米洛利處理組的膀胱ICCs細(xì)胞內(nèi)Ca2+波動(dòng)頻率和振幅下調(diào)顯著(Plt;0.01),而對(duì)照組前后變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
結(jié)論:
阿米洛利可以降低膀胱ICCs細(xì)胞內(nèi)Ca2+波動(dòng)頻率和振幅。
【關(guān)鍵詞】膀胱;間質(zhì)細(xì)胞;阿米洛利;鈣離子波動(dòng)【中圖分類號(hào)】R473【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1001-5213(2016)08-0414-02膀胱是一種介于自主神經(jīng)和非自主神經(jīng)支配的一種特殊的空腔臟器[1]。
傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為:
膀胱收縮存在神經(jīng)源性和肌源性兩種學(xué)說(shuō)[2]。
雖然從膀胱正常收縮完全受意識(shí)控,神經(jīng)源性控制說(shuō)看其合理性是毋庸置疑的。
但在一些特定情況下,諸如膀胱過(guò)度活動(dòng)綜合癥(OveractiveBladder,OAB),患者的膀胱黏膜無(wú)明顯病理變化(或者說(shuō)目前有我們未知的病理改變)而出現(xiàn)非充盈性膀胱異?;顒?dòng),提示膀胱有可能還受其它機(jī)制調(diào)控。
這種情況下,膀胱的收縮更多的表現(xiàn)為肌源性特征,呈現(xiàn)出一定程度的非神經(jīng)源性的自主性。
以往的觀點(diǎn)認(rèn)為這種自發(fā)性興奮起搏來(lái)源于逼尿肌細(xì)胞,但更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明:
逼尿肌細(xì)胞沒(méi)有自發(fā)性興奮的特點(diǎn),無(wú)法擔(dān)當(dāng)膀胱起搏的任務(wù)[3]。
綜合OAB的病因來(lái)看,多種因素參與致病。
Kubota[4]等人研究發(fā)現(xiàn):
膀胱出口梗阻情況下,OAB膀胱中ICCs樣細(xì)胞顯著增多,提示OAB的發(fā)生可能和ICCs細(xì)胞增多;McCloskey[5]和Hashitani[6]等研究發(fā)現(xiàn)逼尿肌的自發(fā)性電活動(dòng)源于逼尿肌束邊緣的ICCs樣細(xì)胞,這些細(xì)胞首先產(chǎn)生自發(fā)性電活動(dòng),隨后刺激逼尿肌細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位,并通過(guò)肌間的縫隙連接傳導(dǎo),引起其他肌束的電位變化的收縮活動(dòng)。
分布在膀胱逼尿肌肌束間的膀胱ICCs細(xì)胞,可通過(guò)胞體間的縫隙連接及ICCs細(xì)胞的突起相互形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)聯(lián)系,并伸出突起到肌束內(nèi)與平滑肌或神經(jīng)組織相聯(lián)系,縫隙連接是在相鄰細(xì)胞間的縫隙中構(gòu)成一個(gè)通道,細(xì)胞胞質(zhì)中的離子和小分子物質(zhì)可以通過(guò)這一通道相互溝通,進(jìn)行細(xì)胞間通訊,使興奮信號(hào)得到迅速傳播[7]。
原代培養(yǎng)的ICCs細(xì)胞和逼尿肌細(xì)胞的靜息膜電位、膜電容存在明顯差異;ICCs細(xì)胞可記錄到起搏細(xì)胞特征電流Ih,而在逼尿肌細(xì)胞則記錄不到[8],同時(shí)膀胱ICCs細(xì)胞表面存在多種受體蛋白,最近有關(guān)超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道(hyperpolatization-activated,cyclicnucleotide-gatedcationchannel,HCN陽(yáng)離子通道,簡(jiǎn)稱HCN通道)在ICCs細(xì)胞膜上的發(fā)現(xiàn)為其是膀胱活動(dòng)的潛在起搏點(diǎn)提供一重要依據(jù)[9]。
由此可見(jiàn)ICCs對(duì)在膀胱逼尿肌異常收縮的病理過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。
同時(shí)我們?cè)O(shè)想的一個(gè)問(wèn)題是:
有沒(méi)有一種藥能夠通過(guò)透過(guò)膀胱粘膜影響膀胱ICCs細(xì)胞從而抑制逼尿肌異常收縮?本實(shí)驗(yàn)將在細(xì)胞水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探討酸敏感離子通道抑制劑阿米洛利(Ami)對(duì)膀胱ICCs細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響,從而為通過(guò)阿米洛利影響膀胱ICCs為中間環(huán)節(jié),間接影響膀胱逼尿肌收縮,為治療膀胱異常收縮的相關(guān)疾病提供相關(guān)的基礎(chǔ)研究。
材料和方法1、材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:
健康成年SD大鼠,雌雄不限,體質(zhì)量200~250g。
主要試劑:
DMEM培養(yǎng)液、Ⅱ型膠原酶(Sigma,美國(guó))、胎牛血清(FBS,Hycone公司)、Ficoll400細(xì)胞分離液(Pharmacia,美國(guó))、青鏈雙抗(哈爾濱哈藥集團(tuán),哈爾濱)、Alexa488標(biāo)記的兔抗羊熒光二抗、羊抗大鼠c-kit多克隆抗體(SantaCruz公司)、Fluo-3-AM(invitrogen公司)、鹽酸阿米洛利(Sigma,美國(guó))、胰蛋白酶抑制劑(Sigma,美國(guó))、L-多聚賴氨酸(Sigma,美國(guó))、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF,Ramp;D公司)2、實(shí)驗(yàn)方法2.1體外膀胱ICCs的分離與培養(yǎng)2.1.1酶解液的配制:
Ⅱ型膠原酶10mg、牛血清白蛋白10mg、胰酶抑制劑10mg,放入小培養(yǎng)瓶中,加入D-Hank’s5ml,充分溶解,濾頭過(guò)濾后備用。
2.1.2標(biāo)本的分離制備:
動(dòng)物采用SD大鼠2-3月齡,體質(zhì)量200-250g,提前沿下腹剪毛,斷頸法處死動(dòng)物,超凈工作臺(tái)內(nèi)大鼠備皮處消毒后,在大鼠恥骨聯(lián)合后方尋找辨認(rèn)膀胱后取出膀胱,將膀胱組織放入冷D-Hank’s(PH7.0)液中漂洗數(shù)分鐘,在解剖顯微鏡下縱行剪開(kāi)膀胱,小心撕去膀胱粘膜和漿膜層后,制成細(xì)小肌條,并用D-Hankrsquo;s反復(fù)沖洗肌條3次。
將膀胱肌條剪成1times;1times;1mm3組織塊。
2.1.3細(xì)胞懸液制作:
將組織塊移入培養(yǎng)瓶,加入配制好的酶解液充分混勻,37℃培養(yǎng)箱中消化15分鐘,期間用吸管吹打2次,將消化好的組織懸液移入離心管離心,1500rpmtimes;5分鐘,棄上清,去除消化酶;在離心管中加入等量D-Hank’s,吹打混勻,組織懸液用200目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾,去除組織碎塊;將細(xì)胞懸液加進(jìn)等體積的密度梯度分離液Ficoll400,1000r/min離心7min,棄上清。
2.1.4接種:
將分離好的細(xì)胞懸液加入適當(dāng)?shù)腄MEM培養(yǎng)基(含DMEM成分、10%FBS、1mlAntibiotic、SCF50ng/ml),取0.1ml的細(xì)胞液滴到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,計(jì)算細(xì)胞密度將細(xì)胞濃度調(diào)整至1times;106/ml并接種至6孔培養(yǎng)板,板中預(yù)先放置包被貼黏多聚賴氨酸的蓋玻片。
放入培養(yǎng)箱內(nèi),在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。
培養(yǎng)24h后換液,去除未貼壁細(xì)胞,加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),以后每隔1d換液一次,期間用倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
2.2膀胱ICCs細(xì)胞的鑒定細(xì)胞穩(wěn)定爬片培養(yǎng)5d后,進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。
步驟:
傾去培養(yǎng)基,用0.01mol/PBS漂洗,5mintimes;3次;室溫下用4%多聚甲醛固定30min,0.01mol/PBS漂洗5mintimes;3次,在室溫下加入10%BSA封閉30min棄液;0.2%TritonX-100(10mlPBS,20mu;lTritonX-100)透膜15min棄液,;羊抗大鼠c-kit多克隆抗體(1:
500稀釋)滴到細(xì)胞片上,4℃過(guò)夜;次日0.01mol/PBS沖洗3次,每次5min;加入AlexaFluo488標(biāo)記的羊抗兔二抗(1:150稀釋),37℃孵育1小時(shí),0.01mol/PBS漂洗5分鐘times;3次;最后DIPI染核,指甲油封片后供激光共聚焦顯微鏡觀察。
2.3阿米洛利對(duì)膀胱ICCs細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的影響2.3.1染液配制:
Fluo-3-AM50ug溶于45ulDMSO(Fluo-3-AM濃度1mM),15ul/支分裝,-20℃保存。
染色時(shí)用15~50mMHEPES緩沖液將其稀釋為1~20uM(如1.5ml為10uM)。
必要時(shí),可加入助染劑HBSS增強(qiáng)染色效果。
2.3.2染色步驟:
1)取在圓形蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞,緩沖液漂洗2~3次。
2)對(duì)照組加入500mu;lPBS,實(shí)驗(yàn)組加入同濃度Fluo-3-AM(1~20uM),37℃下孵育30分鐘。
3)緩沖液漂洗2~3次。
4)加0.5ml緩沖液,上機(jī)測(cè)量。
2.3.3細(xì)胞分組:
將待實(shí)驗(yàn)細(xì)胞爬片分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。
實(shí)驗(yàn)組分別以50mu;mol/L和100mu;mol/L的阿米洛利的PBS溶液孵育30分鐘,對(duì)照組以PBS孵育。
隨機(jī)選取20個(gè)目標(biāo)細(xì)胞,要求選擇顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)典型的、與周圍細(xì)胞無(wú)接觸孤立的ICCs細(xì)胞,用藥前、用藥后分別進(jìn)行檢測(cè),最后采用樣本均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)假設(shè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水平Plt;0.050為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.結(jié)果3.1膀胱ICCs的分離與培養(yǎng)結(jié)果對(duì)大鼠膀胱細(xì)胞分離并培養(yǎng)8h后通過(guò)相差顯微鏡觀察,可發(fā)現(xiàn)胞體呈紡錘狀、梭形貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞,胞體較小,折光性強(qiáng),有兩個(gè)長(zhǎng)的突起或多個(gè)短的側(cè)突,梭形細(xì)胞兩極可見(jiàn)有兩個(gè)或多個(gè)突起的膀胱ICCs細(xì)胞,視野中偶見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞(SMC)其形態(tài)上與膀胱ICCs細(xì)胞有明顯區(qū)別,呈現(xiàn)短棒狀,ICCs-SMC可見(jiàn)類似神經(jīng)-肌肉突觸鏈接樣結(jié)構(gòu)單元(圖1-A)。
培養(yǎng)72h后可見(jiàn)膀胱ICCs細(xì)胞突起間相互接觸(圖1-B),原代分離培養(yǎng)8h膀胱ICCs光鏡下形態(tài),藍(lán)色箭頭指示大鼠膀胱cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICCs),藍(lán)色箭頭指示膀胱平滑肌細(xì)胞(SMC),可見(jiàn)ICCs-SMC間借助ICCs的突起相接處。
(times;40倍)(圖1-A);原代分離培養(yǎng)72h膀胱ICCs光鏡下形態(tài),可見(jiàn)ICCs-ICCs間突起相互交錯(cuò)、接觸成網(wǎng)狀,部分ICCs細(xì)胞胞體呈紡錘形,折光性強(qiáng),其中夾雜少量平滑肌肌細(xì)胞。
(times;20倍)(圖1-B)3.2膀胱ICCs細(xì)胞的鑒定待細(xì)胞穩(wěn)定爬片培養(yǎng)5d后行C-Kit免疫熒光抗體鑒定膀胱ICCs細(xì)胞,結(jié)果提示此類貼壁細(xì)胞C-Kit染色呈陽(yáng)性,提示為膀胱ICCs細(xì)胞(圖2-A及圖2-B)。
膀胱ICCs培養(yǎng)5d后,免疫熒光染色激光共聚焦下細(xì)胞形態(tài),紅色為細(xì)胞核,胞體C-kit受體熒光染色呈綠色,兩端可見(jiàn)長(zhǎng)的細(xì)胞突起,形成ICCs-ICCs間突起相互交錯(cuò)、接觸成網(wǎng)狀,細(xì)胞核與胞體重疊部分顯色成淡黃色。
(圖2-A);膀胱ICCs細(xì)胞DIPI染核,細(xì)胞核呈紅色,標(biāo)尺。
(圖2-B)3.3應(yīng)用共聚焦顯微鏡鏡觀察阿米洛利對(duì)膀胱ICCs細(xì)胞內(nèi)的Ca2+波動(dòng)的影響,統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料以均數(shù)plusmn;標(biāo)準(zhǔn)差表示,檢驗(yàn)方法采用配對(duì)t檢驗(yàn)。
對(duì)照組的膀胱ICCs細(xì)胞呈有規(guī)律的亮度波動(dòng),Ca2+波動(dòng)振幅、頻率變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
而在被Ami孵育的實(shí)驗(yàn)組中,與加藥之前相比,實(shí)驗(yàn)1組(50mu;mol/L阿米洛利處理),膀胱ICCs細(xì)胞的Ca2+波動(dòng)較孵育前有所頻率減慢但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但Ca2+波動(dòng)振幅明顯較前變小,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01);而實(shí)驗(yàn)2組(100mu;mol/L阿米洛利處理)的膀胱ICCs細(xì)胞的Ca2+波動(dòng)這種頻率和振幅下調(diào)的現(xiàn)象更為顯著(Plt;0.01)。
6.討論膀胱的貯尿、排尿功能有乃于膀胱結(jié)構(gòu)的完整外還受自主神經(jīng)支配。
目前的研究表明膀胱黏膜由外向內(nèi)由3種明顯的細(xì)胞層:
基底細(xì)胞層;中間細(xì)胞層;傘狀細(xì)胞層。
傘狀細(xì)胞層表面由葡萄糖胺聚糖層(GAG)、Uroplakin班及盤(pán)狀小泡、封閉帶組成的防水層。
Birder[10]等在對(duì)尿路上皮細(xì)胞的研究表明其具有感覺(jué)并且發(fā)出信號(hào)的特征,這使得它們能夠?qū)χ車奈锢砗突瘜W(xué)環(huán)境變化做出反應(yīng),并且傳遞給膀胱壁的下級(jí)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)。
最近的有關(guān)超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道(HCN陽(yáng)離子通道,簡(jiǎn)稱HCN通道)在ICCs胞膜上的發(fā)現(xiàn)為其膀胱活動(dòng)的潛在起搏點(diǎn)提供一重要依據(jù)。
HCN離子通道在心臟的竇房結(jié)細(xì)胞,神經(jīng)元細(xì)胞等自律性細(xì)胞上被發(fā)現(xiàn),被認(rèn)為是起搏細(xì)胞的重要特征,同時(shí)HCN通道是產(chǎn)生起搏電流Ih(hyperpolarization-activatedinwardcurrent)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
相關(guān)研究表明Ih特異性阻斷劑ZD7288對(duì)ICCs細(xì)胞Ih有明顯抑制作用,從而可以抑制逼尿肌的收縮活動(dòng),而膀胱ICCs與神經(jīng)末梢間存在傳導(dǎo)電信號(hào)的縫隙連接,表明膀胱ICCs細(xì)胞可能是神經(jīng)膀胱ICCs細(xì)胞逼尿肌這一信號(hào)傳導(dǎo)通路的中間環(huán)節(jié),為以膀胱ICCs細(xì)胞為靶點(diǎn)治療膀胱異?;顒?dòng)性疾病提供了依據(jù)。
Fluo-3-AM是一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光探針。
Fluo-3若以游離配體形式存在時(shí)幾乎是非熒光性的,但是當(dāng)它與鈣離子Ca2+結(jié)合后熒光會(huì)增加60至80倍,是目前最常用的一種鈣離子熒光探針。
Fluo-3-AM被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后,被酯酶水解釋出Fluo-3,F(xiàn)luo-3會(huì)與Ca2+絡(luò)合,受488nm的激光激發(fā)而產(chǎn)生熒光,其熒光值與[Ca2+]i呈正相關(guān),即以熒光值變化表示[Ca2+]i變化,在激光掃描共聚焦顯微鏡TimeSeries程序下對(duì)細(xì)胞XY平面進(jìn)行掃描,基礎(chǔ)熒光值在圖像分析程序下按最小噪聲最大圖像信號(hào)人為設(shè)定。
計(jì)算細(xì)胞XY平面內(nèi)平均熒光強(qiáng)度,以平均熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)Ca2+。
本實(shí)驗(yàn)成功體外、分離培養(yǎng)大鼠膀胱ICCs細(xì)胞,對(duì)大鼠膀胱細(xì)胞分離并培養(yǎng)8h后通過(guò)相差顯微鏡觀察,可發(fā)現(xiàn)胞體呈紡錘狀、梭形貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞,胞體較小,折光性強(qiáng),有兩個(gè)長(zhǎng)的突起或多個(gè)短的側(cè)突,梭形細(xì)胞兩極可見(jiàn)有兩個(gè)或多個(gè)突起的膀胱ICCs細(xì)胞,視野中偶見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞(SMC)其形態(tài)上與膀胱ICCs細(xì)胞有明顯區(qū)別,呈現(xiàn)短棒狀,ICCs-SMC可見(jiàn)類似神經(jīng)-肌肉突觸鏈接樣結(jié)構(gòu)單元(圖1-A)。
培養(yǎng)72h后可見(jiàn)膀胱ICCs細(xì)胞突起間相互接觸(圖1-B),待細(xì)胞穩(wěn)定爬片培養(yǎng)5d后行C-Kit免疫熒光抗體鑒定膀胱ICCs細(xì)胞,結(jié)果提示此類貼壁細(xì)胞C-Kit染色呈陽(yáng)性,提示為膀胱ICCs細(xì)胞,為膀胱ICCs細(xì)胞在逼尿肌異?;顒?dòng)相關(guān)疾病的研究提供了基本的實(shí)驗(yàn)探索,SCF(干細(xì)胞生長(zhǎng)因子)為ICCs細(xì)胞膜C-kit的配體,培養(yǎng)液中加入干細(xì)胞生長(zhǎng)因子,是維持ICCs細(xì)胞表型和功能的關(guān)鍵;是進(jìn)行該類研究的基礎(chǔ)。
本研究采用細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光探針(Fluo-3-AM)檢測(cè)經(jīng)阿米洛利處理后膀胱ICCs細(xì)胞[Ca2+]i變化。
結(jié)果表明:
對(duì)照組的膀胱ICCs細(xì)胞以PBS孵育前后仍有規(guī)律的亮度波動(dòng),Ca2+波動(dòng)振幅、頻率變化前后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
而在被Ami孵育的實(shí)驗(yàn)組中,與加藥之前相比,實(shí)驗(yàn)1組(50mu;mol/L阿米洛利處理),膀胱ICCs細(xì)胞的Ca2+波動(dòng)較孵育前有所頻率減慢但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但Ca2+波動(dòng)振幅明顯較前變小,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01);實(shí)驗(yàn)2組(100mu;mol/L阿米洛利處理)的膀胱ICCs細(xì)胞的Ca2+波動(dòng)和振幅均下調(diào),且下調(diào)較明顯,有顯著差異,統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(Plt;0.01)。
甲磺酸伊馬替尼(Glivec)在體內(nèi)外均可在細(xì)胞水平上抑制酪氨酸激酶C受體,實(shí)驗(yàn)表明甲磺酸伊馬替尼可以與ICCs細(xì)胞表面的酪氨酸激酶C受體結(jié)合并特異性阻斷酪氨酸激酶C受體,致使ICCs細(xì)胞內(nèi)Ca2+波動(dòng)頻率、振幅下降,通使用Glivec后進(jìn)行FRAP(熒光漂白實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):
膀胱ICCs細(xì)胞與逼尿肌細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞被明顯抑制。
鹽酸阿米洛利也有相似作用,由于膀胱GAG層細(xì)胞不能阻止鹽酸阿米洛利進(jìn)入并影響傘狀細(xì)胞上皮表面的鈉通道功能,同時(shí)可以影響膀胱ICCs細(xì)胞內(nèi)鈣離子波動(dòng),為優(yōu)勢(shì),但其能否在膀胱灌注治療時(shí)透過(guò)膀胱粘膜而抑制膀胱ICCs而影響膀胱平滑肌的收縮尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
酸敏感離子通道(acid-sensingionchannels,ASICs)是一類由胞外液體酸化所激活的陽(yáng)離子通道,酸化激活后產(chǎn)生電流并影響相關(guān)靶器官。
到目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ASICs家族的6個(gè)亞基ASIC1a、ASIC1b、ASIC2b、ASIC3、ASIC4。
這6個(gè)亞基可以按照不同的模式,組成同聚體或異聚體酸敏感離子通道。
已初步探明ASICs在人體內(nèi)廣泛分布,在觸覺(jué)、痛覺(jué)、酸味覺(jué)、學(xué)習(xí)記憶以及部分病理反應(yīng)中具有重要作用。
李霞等研究發(fā)現(xiàn):
在脊髓背根有ASIC3較多的表達(dá),與痛覺(jué)及傷害性感受密切相關(guān),在慢性炎性疼痛的病理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,在炎性痛模型中可以增加脊髓背根ASIC3在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá);阻斷或敲除ASIC3基因(ASIC3-/-)能明顯抑制炎癥性關(guān)節(jié)痛。
上述研究表明,在生理或病理情況下,脊髓背根中ASIC3對(duì)脊髓水平的感覺(jué)信息傳遞特別是痛覺(jué)的傳導(dǎo)可能發(fā)揮著重要作用,這可能是關(guān)節(jié)炎疼痛的治療靶點(diǎn)。
有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn):
激活A(yù)SIC3可以刺激小腸迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)元產(chǎn)生相應(yīng)的電流改變,進(jìn)而影響小腸平滑肌的收縮。
由此提出ASIC3與胃腸道收縮可能有一定的聯(lián)系。
ASIC3抑制劑鹽酸阿米洛利臨床上為保鉀利尿藥或鈉氫交換抑制劑。
目前除抑制ASICs外,短時(shí)間低劑量的的膀胱灌注不會(huì)產(chǎn)生任何的藥理作用。
由于ASIC3與痛覺(jué)和平滑肌收縮密切相關(guān),OAB癥狀通常伴有不同程度的膀胱疼痛以及膀胱逼尿肌亢進(jìn)。
因此我們大膽設(shè)想:
阿米洛利對(duì)膀胱ICCs細(xì)胞內(nèi)Ca2+抑制波動(dòng)的作用是否通過(guò)抑制ASIC3的表達(dá)通路完成的,其作用機(jī)制值得深入研究。
值得提出的是:
甲磺酸伊馬替尼(Glivec)雖然可以抑制膀胱ICCs細(xì)胞與逼尿肌細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞,但尚無(wú)磺酸伊馬替尼(Glivec)能自由通過(guò)膀胱灌注進(jìn)入黏膜下層的相關(guān)研究;同時(shí)其價(jià)格昂貴,難以在臨床上普及使用,而阿米洛利價(jià)格便宜。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證明阿米洛利對(duì)膀胱ICCs細(xì)胞內(nèi)Ca2+抑制波動(dòng)的作用,為OAB等膀胱異?;顒?dòng)的進(jìn)一步研究提供新的思路。
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