3.1基因表達(dá)載體的構(gòu)建高二下學(xué)期生物選擇性必修三

情景啟思1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。你知道獲得了足量的Bt基因后，是否能直接將Bt基因?qū)朊藁?xì)胞？那怎樣才能讓基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代呢？情景啟思游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)直接被分解。

即使可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無(wú)法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因。不能復(fù)制原點(diǎn)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)目的基因插入位點(diǎn)氨芐青霉素抗性基因(標(biāo)記基因)

一、基因表達(dá)載體的組成基因表達(dá)載體1.結(jié)合基因表達(dá)載體模式圖分析以下問(wèn)題：(1)圖中a、b、c分別代表什么結(jié)構(gòu)？作用是什么?(2)為什么目的基因要插入啟動(dòng)子和終止子之間？

合作探究1：基因表達(dá)載體的組成

a為啟動(dòng)子、b為終止子、c為復(fù)制原點(diǎn)。啟動(dòng)子位于目的基因的首端使轉(zhuǎn)錄開(kāi)始，是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合的部位；終止子位于目的基因的尾端，使轉(zhuǎn)錄終止；只有順序正確，目的基因才能正常轉(zhuǎn)錄。(3)啟動(dòng)子和終止子與起始密碼子和終止密碼子是一回事嗎？不是一回事，啟動(dòng)子和終止子位于DNA上，是基因表達(dá)載體必需的部分。而起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開(kāi)始和結(jié)束。一、基因表達(dá)載體的組成目的基因：能控制表達(dá)所需要的特殊性狀啟動(dòng)子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。復(fù)制原點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)終止子：位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：便于重組DNA分子的篩選和鑒定?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程

二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程

+DNA連接酶小組活動(dòng)：嘗試構(gòu)建基因表達(dá)載體的物理模型1.若用同一種限制酶切割（單酶切）后獲得的干擾素基因與載體混合，并用DNA連接酶處理后，會(huì)出現(xiàn)幾種結(jié)果？單酶切有什么缺點(diǎn)?EcoRI補(bǔ)充說(shuō)明：（剪刀模擬限制酶，透明膠帶模擬DNA連接酶）載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接反向連接11’22’122’1’21’12’正向連接

用同種限制酶切割（單酶切）載體和目的基因有什么缺點(diǎn)?②質(zhì)粒與目的基因會(huì)發(fā)生反向連接①質(zhì)粒、目的基因會(huì)發(fā)生自身環(huán)化連接小組活動(dòng)：嘗試構(gòu)建基因表達(dá)載體的物理模型小組活動(dòng)：嘗試構(gòu)建基因表達(dá)載體的物理模型2.若使用二種限制酶（雙酶切）后獲得的干擾素基因與載體混合，并用DNA連接酶處理后，會(huì)出現(xiàn)幾種結(jié)果？雙酶切有什么優(yōu)點(diǎn)?BamHIEcoRI

1種情況，

并使用

目的基因和載體定向連接

學(xué)以致用1.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，需構(gòu)建基因表達(dá)載體，圖甲、乙表示質(zhì)粒及目的基因所在DNA片段，圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的切割位點(diǎn)。(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需要使用的工具酶？(2)用圖中質(zhì)粒和DNA構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，不能使用SmaⅠ切割，原因？(3)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，可用EcoRⅠ同時(shí)切割質(zhì)粒和DNA，但會(huì)導(dǎo)致？（4）為避免以上問(wèn)題出現(xiàn)，應(yīng)使用那兩種限制酶限制酶和DNA連接酶SmaⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化、目的基因不能定向連接BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)歸納總結(jié)

限制酶的選擇原則歸納總結(jié)歸納總結(jié)（4）歸納總結(jié)限制酶的選擇原則a、不能破壞目的基因b、不能破壞所有的標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子和復(fù)制原點(diǎn)c、切割后目的基因和質(zhì)粒有相同的黏性末端（最好采用雙酶切：避免自身環(huán)化和反向連接）(2)用圖中質(zhì)粒和DNA構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，不能使用SmaⅠ切割，原因？SmaⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因（4）為避免以上問(wèn)題出現(xiàn)，應(yīng)使用那兩種限制酶BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)根據(jù)D課堂評(píng)價(jià)12.圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述不正確的是A.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用PstⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNAB.在酶切過(guò)程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因C.若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，無(wú)法避免自身環(huán)化和反向連接D.導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1．(多選)(2023·江蘇蘇州高二期末)某科研小組利用質(zhì)粒(圖甲)和目的基因(圖乙)構(gòu)建重組DNA。下列分析正確的是(

)A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割質(zhì)粒，可得到2條DNA片段B．不能用AluⅠ酶切割質(zhì)粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶會(huì)破壞目的基因C．構(gòu)建重組DNA時(shí)，需選擇SmaⅠ酶和PstⅠ酶同時(shí)切割質(zhì)粒和外源DNAD．導(dǎo)入了重組DNA的細(xì)菌能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而不能在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)課堂評(píng)價(jià)2ABDHindⅢ

PstⅠ4．(2023·江蘇南通高二期中)如圖表示pBR322質(zhì)粒和人生長(zhǎng)激素基因所在片段的結(jié)構(gòu)信息，將二者構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌并進(jìn)行篩選。下列有關(guān)敘述正確的是(

)課堂評(píng)價(jià)3注：AmpR為氨芐青霉素抗性基因，Te