液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程第5部分：紅托竹蓀

1液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程第5部分：紅托竹蓀本文件規(guī)定了紅托竹蓀（學(xué)名為紅托鬼筆，Phallusrubrovolvatus(M.Zang,D.G.Ji&X.X.Liu)Kreisel）液體菌種的術(shù)語(yǔ)和定義、生產(chǎn)基本要求、生產(chǎn)工藝流程、搖瓶液體菌種生產(chǎn)技術(shù)、發(fā)酵罐菌種生產(chǎn)技術(shù)、放罐接種等內(nèi)容。本文件適用于紅托竹蓀液體菌種的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB150壓力容器GB4789.28食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB50073潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范GB/T12728食用菌術(shù)語(yǔ)NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1731食用菌菌種良好作業(yè)規(guī)范NY/T1742食用菌菌種通用技術(shù)要求NY/T1846食用菌菌種檢驗(yàn)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義GB/T12728和NY/T528界定的術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1紅托竹蓀Phalusrubrovolvatus(M.Zang,D.G.Ji&X.X.Liu)Kreisel紅托竹蓀（學(xué)名為紅托鬼筆，Phallusrubrovolvatus(M.Zang,D.G.Ji&X.X.Liu)Kreisel），又稱織金竹蓀，隸屬真菌門Eumycota、擔(dān)子菌亞門Basidiomycotina、腹菌綱Gasteromycetes、鬼筆目Phallales、鬼筆科Phallaceae、鬼筆屬Phallus。3.2固體菌種solidspawn在玻璃試管、培養(yǎng)皿或聚丙烯瓶等固體培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的純食用菌菌絲體培養(yǎng)物。3.32液體菌種liquidspawn用于生產(chǎn)和銷售的菌絲體及其生長(zhǎng)基質(zhì)組成的液體繁殖材料，包括搖瓶液體菌種、發(fā)酵罐液體菌種。3.4液體菌種發(fā)酵罐cultivationapparatusforliquidspawn進(jìn)行液體菌種培養(yǎng)的專用發(fā)酵設(shè)備，應(yīng)符合GB150要求。3.5發(fā)酵罐空消emptyfermentersterilization對(duì)尚未加水投料的空發(fā)酵罐進(jìn)行高壓滅菌。3.6發(fā)酵罐實(shí)消fermentersterilization對(duì)投料后的發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。3.7罐壓jarpressure在液體菌種發(fā)酵制備過(guò)程中發(fā)酵罐內(nèi)保持的空氣壓力（表壓），單位：MPa。3.8通風(fēng)量ventilationvolume液體菌種培養(yǎng)過(guò)程中每分鐘通入發(fā)酵罐中無(wú)菌空氣體積與發(fā)酵罐實(shí)際料液體積的比例。用V/V表示。4生產(chǎn)技術(shù)要求4.1人員要求具有食用菌菌種生產(chǎn)從業(yè)資格的人員，包括檢驗(yàn)人員，操作符合NY/T1731要求。4.2場(chǎng)地環(huán)境要求生產(chǎn)場(chǎng)地符合NY/T528的要求，場(chǎng)地開(kāi)闊、交通方便、水源和電源充足、路面硬化、衛(wèi)生清潔、排水良好，遠(yuǎn)離畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)、排污口、工礦業(yè)“三廢”及微生物、煙塵和粉塵等污染源。4.3生產(chǎn)車間要求液體菌種生產(chǎn)車間應(yīng)包含原料庫(kù)、配料間、滅菌室、冷卻間、接種間、培養(yǎng)室、化驗(yàn)室、菌種室等，并配備相應(yīng)設(shè)施設(shè)備，規(guī)模配套，布局合理，設(shè)計(jì)符合GB50073要求。車間地面要具備防水、防腐、防滲漏、防滑性能，易清洗，應(yīng)有1.0°~1.5°的排水坡度和良好的排水系統(tǒng)。墻壁和天花板應(yīng)具有防潮、防霉、防水性能。門窗應(yīng)設(shè)置防蚊蠅紗網(wǎng)。車間安裝排氣管道或者排風(fēng)設(shè)備。車間設(shè)封閉式廢物桶。4.4主要生產(chǎn)設(shè)備要求3應(yīng)具有磅秤、天平、高壓蒸汽滅菌鍋、發(fā)酵罐、液體菌種接種器、超凈工作臺(tái)、調(diào)溫設(shè)備、除濕設(shè)備、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床或磁力攪拌器、冰箱、顯微鏡等滅菌設(shè)備及常規(guī)用具。壓力容器應(yīng)經(jīng)政府有關(guān)部門檢驗(yàn)合格，符合GB150要求。應(yīng)具有備用電源。4.5生產(chǎn)原料化學(xué)試劑類、生物制劑及天然材料類應(yīng)符合NY/T528要求，同時(shí)水不溶物物料需過(guò)40目篩；生產(chǎn)用水應(yīng)符合GB5749要求。5生產(chǎn)工藝流程工藝流程見(jiàn)圖16母種制備按照附錄A.1配方制備培養(yǎng)基，母種培養(yǎng)操作流程應(yīng)符合NY/T528要求，并按NY/T1846規(guī)定抽樣，進(jìn)行感官檢驗(yàn)和菌絲微觀特征檢驗(yàn)，合格菌種進(jìn)入生產(chǎn)流程。母種質(zhì)量要求符合NY/T1742關(guān)于母種質(zhì)量的規(guī)定。7搖瓶液體菌種生產(chǎn)技術(shù)7.1液體培養(yǎng)基的制作7.1.1培養(yǎng)基配制與分裝按照附錄A.2配方配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)物料先用水?dāng)嚢杈鶆蚝螅b入搖瓶中，裝液量為150mL/500mL，瓶口用12~16層紗布塞封口，外用15cm×15cm聚丙烯膜或牛皮紙包扎，并用線繩扎緊。7.1.2滅菌將分裝好的三角瓶放入滅菌鍋內(nèi)，鍋內(nèi)留有一定的空隙。檢查鍋內(nèi)水位，立即滅菌。滅菌蒸汽壓力升至0.1MPa~0.12MPa，溫度達(dá)121℃時(shí)，滅菌30min。47.1.3冷卻將滅菌后的液體培養(yǎng)基放入超凈工作臺(tái)中，冷卻至室溫。7.2接種在超凈工作臺(tái)中嚴(yán)格按無(wú)菌操作規(guī)程，將合格的母種斜面菌絲體切割成（3~5）mm×（3~5）mm的菌塊，接種到已冷卻的搖瓶液體培養(yǎng)基中，每150mL液體培養(yǎng)基中接入20塊~30塊。接種完成后及時(shí)貼好標(biāo)簽，即為一級(jí)液體菌種。取檢測(cè)合格的一級(jí)液體菌種，按照10%的接種量接入搖瓶液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)可制備二級(jí)液體菌種。7.3培養(yǎng)菌種培養(yǎng)溫度26℃,避光振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。每日檢查生長(zhǎng)狀態(tài)，及時(shí)檢出不合格菌種。搖瓶靜置1min后，菌絲球體積占比液體培養(yǎng)基體積的80%以上，可結(jié)束培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間約為15d左右。7.4搖瓶菌種檢驗(yàn)期間每天觀察，及時(shí)去除污染菌種。培養(yǎng)液應(yīng)澄清透明，無(wú)雜菌、無(wú)異味；鏡檢無(wú)雜菌、菌絲形態(tài)正常；菌絲球、菌絲片段密集，菌球均勻懸浮于液體培養(yǎng)基中不分層。7.5入庫(kù)與記錄完成培養(yǎng)的搖瓶液體菌種應(yīng)登記入庫(kù)。搖瓶液體菌種生產(chǎn)各環(huán)節(jié)應(yīng)詳細(xì)記錄。7.6留樣菌種應(yīng)留樣備查，留樣的數(shù)量應(yīng)以每個(gè)批號(hào)3份~5份，于4℃下貯存，貯存至經(jīng)發(fā)酵罐菌種轉(zhuǎn)接的菌棒出菇結(jié)束為止。8發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)8.1空氣過(guò)濾器的檢查使用前應(yīng)拆分檢查空氣過(guò)濾器濾芯，要求無(wú)油污、料污、無(wú)破損，外殼內(nèi)外壁要求無(wú)污物、光亮潔8.2發(fā)酵罐檢查與清洗檢查罐上全部閥門、壓力表，要求完好、工作正常。對(duì)罐體內(nèi)、外和全部閥門用流水進(jìn)行沖洗，達(dá)到無(wú)死角、內(nèi)壁無(wú)任何培養(yǎng)料殘余物的潔凈程度。8.3空消滅菌發(fā)酵罐空消條件：罐體壓力0.120Mpa~0.140Mpa、溫度達(dá)121℃~126℃時(shí)，高壓蒸汽滅菌30min。5發(fā)酵罐初次使用、出現(xiàn)雜菌、長(zhǎng)期放置、更換品種等情況出現(xiàn)其一時(shí)，需進(jìn)行間歇空消，即空消一次后間隔2h~3h再空消一次。8.4投料定容將配制好的液體培養(yǎng)基原料充分溶解，加適量溫水?dāng)嚢杈鶆?，倒入或用泵抽入發(fā)酵罐中，加水定容至所需體積（液體培養(yǎng)基占罐體總?cè)莘e的70%），擰緊上料口蓋。8.5實(shí)消與冷卻滅菌時(shí)間30min。實(shí)消滅菌結(jié)束后將冷水通入發(fā)酵罐夾層或者內(nèi)置冷卻系統(tǒng)中循環(huán)，使液體培養(yǎng)基降溫至26℃以下。降溫過(guò)程中及時(shí)向發(fā)酵罐內(nèi)通無(wú)菌空氣防止罐壓回零。8.6接種利用火焰保護(hù)接種法接入搖甁菌種，接種量為5~10%。把火圈放在投料口的上方點(diǎn)燃，此時(shí)打開(kāi)進(jìn)料口蓋，把搖瓶液體菌種迅速投入罐中，迅速蓋好進(jìn)料口蓋、擰緊。移走火焰圈，液體菌種進(jìn)入培養(yǎng)階段。8.7培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)控制進(jìn)氣閥的無(wú)菌空氣通風(fēng)量1：1V/V、罐壓保持在0.02Mpa~0.05Mpa之間、培養(yǎng)溫度26℃。培養(yǎng)約10d后，發(fā)酵罐菌種即可達(dá)到放罐指標(biāo)。8.8留樣、取樣及檢測(cè)8.8.1留樣、取樣留存搖瓶液體菌種樣品，發(fā)酵罐滅菌后的空白培養(yǎng)基樣品，定期取樣，進(jìn)行鏡檢和無(wú)菌檢測(cè)，上述樣品應(yīng)放4℃冰箱內(nèi)保存一周以上。8.8.2檢測(cè)培養(yǎng)過(guò)程中定期從發(fā)酵罐中取出樣品應(yīng)及時(shí)鏡檢與無(wú)菌檢測(cè)，同時(shí)確定菌絲生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)與排除雜菌污染。a)按照GB4789.28中的規(guī)定，接種后置于28℃~30℃恒溫培養(yǎng)24h~48h，觀察是否有細(xì)菌污染，同時(shí)進(jìn)行鏡檢和感官檢測(cè)。b)按照GB4789.28中的規(guī)定，接種后置于23℃~25℃恒溫培養(yǎng)48h~72h，觀察是否有霉菌污染，同時(shí)進(jìn)行鏡檢和感官檢測(cè)。8.9發(fā)酵罐菌種放罐指標(biāo)發(fā)酵罐菌種放罐感官與理化指標(biāo)見(jiàn)附錄B。9放罐接種6液體菌種達(dá)到放罐指標(biāo)并經(jīng)鏡檢等檢驗(yàn)合格后即可放罐。使用液體菌種接種器將液體菌種注入菌棒。按照接種器接種規(guī)程，接種動(dòng)作迅速、準(zhǔn)確，接種量為25mL~30mL/菌棒（17cm×33cm）。10液體菌種臨時(shí)儲(chǔ)存液體菌種生產(chǎn)后應(yīng)及時(shí)使用，如不能及時(shí)使用，需進(jìn)行儲(chǔ)存。在發(fā)酵罐內(nèi)通入無(wú)菌空氣，保持罐壓0.02Mpa~0.05Mpa時(shí)，料溫4℃保存小于6d。11記錄與存檔母種、搖瓶液體菌種和發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)的每個(gè)環(huán)節(jié)（如：滅菌、培養(yǎng)、檢測(cè)環(huán)節(jié)）都要有詳實(shí)的記錄，由具體操作人員現(xiàn)場(chǎng)填寫，定期審核，簽字后歸檔保存，檔案應(yīng)保存3年以上。7附錄A（資料性）紅托竹蓀液體菌種培養(yǎng)基建議配方A.1母種培養(yǎng)基配方（1L）：柞木屑20g（小于40目，加水1.1~1.2L煮沸15~20min，4層紗布過(guò)濾）、葡萄糖20g、蛋白胨2g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g、瓊脂20g，加水定容至1L，pH自然。A.2液體培養(yǎng)基配方（1L）：柞木屑40g（小于40目，加水1.1~1.2L煮沸15~20min，4層紗布過(guò)濾），紅糖30g，蛋白胨3g，磷酸二氫鉀2.0g，硫酸鎂1.0g，加水定容至1L，pH自然。附錄B（規(guī)范性）放罐指標(biāo)放罐感官指標(biāo)參見(jiàn)表B.1，放罐理化指標(biāo)參見(jiàn)表B.2。表B.1放罐感官指標(biāo)有紅托竹蓀液體培養(yǎng)時(shí)特有的香氣，無(wú)酸、臭等異味，發(fā)酵罐排氣口氣味表B.2放罐理化指標(biāo)可見(jiàn)紅托竹蓀液體菌種培養(yǎng)中特有的菌絲形態(tài)，大平板上有紅托竹蓀菌絲生長(zhǎng)，無(wú)霉菌、酵母菌、附錄C（規(guī)范性）液體菌種生產(chǎn)記錄