DB46T-芒小果普癭蚊檢疫鑒定規(guī)程

Q/LB.□XXXXX-XXXX芒小果普癭蚊檢疫鑒定規(guī)程范圍本文件確立了植物檢疫中芒小果普癭蚊的檢疫鑒定方法。本文件適用于芒小果普癭蚊的檢疫鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。SN/T2122-2015《進(jìn)出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣方法》術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義?；拘畔⒅形拿好⑿」瞻`蚊學(xué)名：ProcontariniafructiculiJiao,Wang,Bu&Kolesi分類地位：隸屬雙翅目Diptera癭蚊科Cecidomyiidae普癭蚊屬Procontarinia。芒小果普癭蚊的生物學(xué)特性參見附錄A。方法原理本標(biāo)準(zhǔn)以形態(tài)特征為主要判定依據(jù)。芒小果普癭蚊（卵或幼蟲或蛹或成蟲）經(jīng)過提取總基因組總DNA后，利用線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I基因（COI）片段的DNA提取、擴(kuò)增和測序，判定癭蚊標(biāo)本的種類是否是芒小果普癭蚊。器材用具和試劑器材用具擴(kuò)增儀，電泳儀，紫外分光光度計(jì)，凝膠成像系統(tǒng)，冰箱，低溫冰箱，制冰機(jī)，水浴鍋，離心機(jī)，電子天平，微量加樣器，體視顯微鏡；放大鏡、小毛筆、鑷子、剪刀、白瓷盤、解剖針、指形管、標(biāo)簽等。試劑本文件所使用試劑參見附錄B.1?，F(xiàn)場檢查對芒果植株或苗木進(jìn)行現(xiàn)場檢查時(shí)，重點(diǎn)檢查幼果、花序和花蕾是否有成蟲產(chǎn)卵，或者幼蟲孵化后蛀食幼果形成的為害蛀孔，是否有活蟲或死蟲，是否有老熟幼蟲出果的蟲孔。對現(xiàn)場檢疫發(fā)現(xiàn)的各種蟲態(tài)用鑷子或毛筆收集，以指形管保存，加貼標(biāo)簽?，F(xiàn)場檢查抽樣參照SN/T2122進(jìn)行。室內(nèi)檢驗(yàn)檢測鏡檢將現(xiàn)場采集的可疑幼蟲、蛹和成蟲送到實(shí)驗(yàn)室，在體視顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)特征的鑒定。PCR法分子檢測對廮蚊類昆蟲進(jìn)行PCR檢測，檢測方法詳見附錄B.2。芒小果普癭蚊鑒定特征普癭蚊屬的形態(tài)特征頭部：具后頭峰，下顎須３節(jié)～４節(jié)。雌雄觸角均具12個(gè)鞭小節(jié)，第１和第２鞭小節(jié)融合。雄蟲觸角鞭小節(jié)呈雙結(jié)狀，端結(jié)和基結(jié)形狀大小接近，其上分別具一圈發(fā)達(dá)的大環(huán)狀環(huán)絲，其頸部相對較長；雌蟲觸角鞭小節(jié)除少數(shù)種類呈與雄蟲相似的雙結(jié)狀外，大多呈單結(jié)狀，結(jié)部具帶狀環(huán)絲，其頸部相對雄蟲較短。胸部：翅透明。R1脈在翅基部１/２靠前處與Ｃ脈匯合；R5脈較直且在翅端處或翅端稍靠前處與Ｃ脈匯合；Cu脈分叉。跗節(jié)爪具基齒或不具齒。雄蟲生殖節(jié)：尾須通常寬大愈合且其端緣中央略微凹陷，少數(shù)種類明顯分２瓣；肛下板端緣中央略微凹陷，但不明顯分瓣；抱器基節(jié)通常具中基瓣，少數(shù)種類中基瓣不明顯；陽莖顯著突出，端部錐狀或較為平鈍，其上著生一定數(shù)量且較小的無毛感覺孔。雌蟲生殖節(jié)：部分種類產(chǎn)卵器具有一定的伸縮性，另一部分種類產(chǎn)卵器不可伸縮；尾須整體愈合或部分分離；肛下板寬圓但不分瓣。芒小果普癭蚊的形態(tài)特征芒小果普癭蚊為害圖及芒小果普癭蚊雄成蟲的特征圖參見附錄C。卵長橢圓形，半透明，體長0.15mm～0.25?mm。幼蟲幼蟲共4個(gè)齡期。黃色至橘黃色。長1.8mm～2.2mm，寬0.5mm～0.6mm。觸角錐形，長約為基部寬的1.6倍～1.8倍。胸叉具2個(gè)齒突，齒突基部隆起，2個(gè)齒突由一個(gè)U形淺凹分開；與胸叉相近的2組側(cè)瘤突有3個(gè)為1組和1個(gè)為1組，均無毛。末節(jié)端部圓鈍，具8個(gè)瘤突，1對較大的瘤突角錐狀，其余3對較小，在中央的1對小瘤突有微毛。較大的瘤突中間部分顏色略深。蛹橘褐色。雄性體長1.0mm，雌性1.4mm～1.5mm。觸角基具微角突；頭部的毛短而細(xì)。前胸氣門不明顯，長而粗壯，向前部漸窄，端部略彎曲，氣管伸達(dá)前端。成蟲雄蟲。體色：頭及胸棕褐色，腹部淺褐色。翅長1.1mm～1.2mm，寬0.5mm～0.6mm。頭:頭頂復(fù)眼橋長6～7個(gè)小眼直徑。下顎須4節(jié)，向端部逐節(jié)漸長。單眼突微隆起。觸角具12節(jié)，第1節(jié)與第2節(jié)融合；梗節(jié)亞球形，略微比柄節(jié)長；鞭節(jié)為雙亞節(jié)，每個(gè)亞節(jié)具一圈環(huán)毛；第3鞭節(jié)中部的無毛區(qū)約為基亞節(jié)長度的0.6～0.7倍，頸部長約為端亞節(jié)長的1.0～1.1倍；基亞節(jié)的環(huán)毛伸至端亞節(jié)中部，端亞節(jié)環(huán)毛伸達(dá)頸部末端。胸部:翅膜質(zhì)，被稀疏細(xì)鱗片，R1脈和C脈在翅前緣的近中部融合；R5脈和C脈交會于翅端部，Rs脈細(xì)縮呈R5脈上的一個(gè)隆起，Cu脈叉狀。各足密被細(xì)鱗和稀疏短毛；前跗節(jié)齒狀；爪間突與前跗節(jié)近等長；爪墊幾不可見。腹部:第1節(jié)至第6節(jié)背板矩形，表面散布鱗片，各節(jié)后緣具單排長毛，側(cè)緣及中部散布短毛，前緣具成對毛狀感器；第7背板似第6背板，稍窄；第8背板似第7背板，但明顯窄??；第2節(jié)至第7節(jié)腹板矩形，具不規(guī)則長毛，側(cè)緣及中部短毛較背板密，前緣具一對緊鄰的毛狀感器；第7腹板稍窄于第6腹板；第8腹板明顯較第7腹板短小。末節(jié)：生殖基節(jié)伸長；生殖基節(jié)基突圓鈍，強(qiáng)烈骨化，密生毛列；生殖突粗壯，向端部齒突逐漸細(xì)縮，基部三分之一密被微毛，其余部分具稀疏短毛；尾突短寬，幾近完全愈合，端緣中部微凹入，端緣具長毛；肛下板窄，略與尾突等長，端部微凹入，端部具若干短毛；陽莖細(xì)長，明顯長于生殖基節(jié)，向端部逐漸變細(xì)，末端背側(cè)1/3具無毛點(diǎn)狀感器，腹側(cè)1/4較稀疏地散布稍大的感器。雌蟲。翅長1.2mm～1.8mm，寬0.6mm～0.7mm。頭具單眼突，微隆起。觸角鞭節(jié)柱狀，第3節(jié)中部略縊縮，頸部約為小節(jié)長的1/3；環(huán)毛緊貼表面，由2條水平方向和2條垂直方向的環(huán)帶交聯(lián)而成。腹部。背板第1節(jié)至第7節(jié)，腹板第2節(jié)至第7節(jié)與雄性相近，但毛及鱗片略多；第8節(jié)背板及腹板未骨化，后緣稀疏散布一排短毛。產(chǎn)卵器較伸長，伸出時(shí)約為腹部其他部分的0.55～0.65倍；第9節(jié)腹面密布短毛，背面無毛被；尾突從端部1/5處分開，密被短毛，背部具若干稀疏長毛，端部具若干中等長度的剛毛；肛下板約為尾突長的1/5，腹面觀端部寬圓，后緣具一對毛。其他部分與雄性相近。結(jié)果判定以成蟲的形態(tài)特征為主要依據(jù)，蛹和幼蟲的形態(tài)特征作參考，符合9.2描述的可鑒定為芒小果普癭蚊。分子檢測結(jié)果判定見附錄B.2.4。標(biāo)本保存芒小果普癭蚊制作成三角紙片標(biāo)本長期保存。

（資料性）

芒小果普癭蚊的生物學(xué)特性A．1寄主僅見報(bào)道為害芒果A．2地理分布菲律賓呂宋島，廣西百色A．3為害特點(diǎn)該蟲主要在土表以蛹越冬。在12月中旬至翌年4月下旬，成蟲羽化，在芒果初花至幼果形成初期，成蟲在嫩梢、花梗、花蕾和幼果上產(chǎn)卵，幼蟲孵化后即蛀食幼果，造成落果。初期受害幼果在下部果皮上的產(chǎn)卵點(diǎn)象炭疽病發(fā)生初期癥狀，在放大鏡下，受害幼果可見清晰的為害蛀孔，剖開米粒大小的幼果，可見長2mm左右的淺黃色幼蟲，有些幼果有多個(gè)蛀孔，多條幼蟲。老熟幼蟲掉入土中化蛹，蛹羽化成下一代成蟲，形成再次為害。在芒果初花期至幼果形成期內(nèi)，該害蟲可發(fā)生數(shù)代。A．4傳播途經(jīng)芒小果普癭蚊成蟲飛行能力較弱，不具備遠(yuǎn)距離擴(kuò)散能力。主要以幼蟲隨寄主果實(shí)、蛹隨寄主附著的土壤，以及卵隨寄主的花或子房進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。

（資料性）

芒小果普癭蚊的分子檢測鑒定試劑TE緩沖液pH8.0，Tris-鹽酸，EDTA，氯化鈉，蛋白酶K，氯仿/異戊醇(v∶v=24∶1)，無水乙醇，75%乙醇，Taq聚合酶，瓊脂糖，DNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒。檢測方法樣本前處理用于分子生物學(xué)試驗(yàn)的癭蚊樣本在提取DNA之前均要作前處理，卵、若蟲、擬蛹、成蟲或部分組織等癭蚊樣本要用無菌水沖洗數(shù)遍，晾干；干標(biāo)本、乙醇或福爾馬林浸泡的標(biāo)本先用緩沖液（TEpH8.0）浸泡處理1h～2h。癭蚊基因組總核酸提取試劑盒法將癭蚊樣本移入1.5mL離心管或碾缽中,搗碎或加入液氮碾磨,之后實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)DNA提取試劑盒的操作說明書操作。癭蚊基因組DNA溶液置于-20℃冷凍保存。提取液法將單頭癭蚊置于滴有20μL提取緩沖液(50mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA、1%SDS、20mmol/LNaCl,pH8.0)的Parafilm膜上，以0.2mL的PCR管底部作為勻漿器充分研磨，50μL緩沖液清洗勻漿器4次、合并混勻；然后以微量移液器移入1.5mL離心管，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混勻后于60℃水浴1h(中途混勻1次)；然后沸水浴5min，加入220μL氯仿/異戊醇(v∶v=24∶1)抽提液，輕柔混勻數(shù)十次后，冰上放置10min，10000r/min離心10min，取上清液，加入440μL預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，待出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于-20℃放置30min，4℃12000r/min離心15min，小心棄去上清液。加入400μL預(yù)冷的75%乙醇洗滌，12000r/min離心15min，小心棄去上清液，然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥20min每管加入30μL超純水，充分溶解后于-20PCR擴(kuò)增提取得到的基因組DNA作為模板于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系為：DNA模板1μl，10×ExTaqBuffer（Mg2+Plus）2.5μl，TaKaRaExTaq0.25μl（1.25U），dNTP0.5μl（100nmol·L-1），引物正向:5'-GGATCACCTGATATAGCATTCCC-3'(COIS)和反向:5′-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3′各0.25μl（250pmol·L-1），加ddH2O補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)條件為：94℃4min，進(jìn)入循環(huán)：94℃30s，50℃45s，72℃45s，共35個(gè)循環(huán)，最后延伸10min。取10μl～15μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳。然后凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。結(jié)果判定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果待測樣品與陽性對照擴(kuò)增出一條大小為446bp的PCR產(chǎn)物帶，陰性對照無DNA產(chǎn)物帶。將產(chǎn)物進(jìn)行測序后，結(jié)果與GenBank系統(tǒng)中芒小果普癭蚊的序列一致則可判定樣本的種類為芒小果普癭蚊。

（資料性）

芒小果普癭蚊為害圖和蛹?xì)ぬ卣鱝aba雌蟲在子房基部花中產(chǎn)卵，b正常果實(shí)（左上角）和有幼蟲逃逸孔的受害果實(shí)（中間）ccdc剖開果實(shí)顯示果實(shí)中的幼蟲及幼蟲室