常見干擾及消除技術學習培訓課件

常見干擾及消除BET干擾的普遍性！一項對人用藥品與鱟試驗相容性的研究證實了干擾的影響范圍，在所研究的品種中僅30%的藥品可以不經(jīng)任何處理直接進行BET；有97%的干擾問題可以通過稀釋供試品的方法去消除。270%！3干擾的表現(xiàn)凝膠法Ch.P.2010規(guī)定無干擾條件：

0.5λ≤Es≤2λ；0.5Es≤Et≤2Es

USP35規(guī)定無干擾條件：

0.5λ≤Es≤2λ；0.5λ≤Et≤2λ平行管數(shù)溶液C（Es）2λλ?λ?λ1＋＋－－2＋＋－－3＋＋－－4＋＋－－平行管數(shù)溶液B（Et）SE2λSEλSE?λSE?λ1＋＋－－2＋＋－－3＋＋－－4＋＋－－最理想的無干擾狀況表a4平行管數(shù)溶液C（Es）2λλ?λ?λ1＋＋＋－2＋＋＋－3＋＋＋－4＋＋＋－平行管數(shù)溶液B（Et）SE2λSEλSE?λSE?λ1＋－－－2＋－－－3＋－－－4＋－－－不符合Ch.P.要求，但符合USP要求表b5平行管數(shù)溶液C（Es）2λλ?λ?λ1＋＋＋－2＋＋＋－3＋＋＋－4＋＋＋－平行管數(shù)溶液B（Et）SE2λSEλSE?λSE?λ1＋＋＋＋2＋＋＋－3＋＋＋－4＋＋＋－符合Ch.P.要求，但不符合USP要求表c出現(xiàn)表b或表c的極端情況均為不適宜的實驗結果，需要檢查實驗條件。67干擾的類型抑制供試品含有的內毒素濃度≥2倍檢測試劑的靈敏度，但檢測結果仍為陰性，稱之為假陰性增強供試品含有的內毒素濃度低于檢測試劑靈敏度的1/2，但檢測結果仍為陽性，稱之為假陽性光度法的判斷？無干擾：50%≤回收率≤200%抑制：回收率＜50%增強：回收率＞200%8干擾的判斷：回收率=？%50%200%無干擾增強抑制鱟試劑內毒素螯合劑聚集高滲透壓酶、酶抑制劑TAL-RM脂質體吸附洗滌劑表面活性劑pH值干擾的因素！9pH值的影響鱟試劑中的酶需要在

pH值6~8的范圍內才能正常反應，極端的pH環(huán)境影響酶的活性，造成抑制一般來說鱟試劑配方中都添加了緩沖劑以幫助樣品的pH值的調節(jié)，但這不足以解決所有樣品的pH問題測定以1:1為比例混合的樣品稀釋液+鱟試劑的pH值以獲得準確的pH值10解決有關pH的問題1用BET水對供試品在允許的范圍內進行稀釋2用緩沖液制備供試品3用酸、堿或緩沖液來調節(jié)pH11螯合問題Mg2+離子是鱟試劑重要的輔因子，沒有Mg2+離子，內毒素將無法激活鱟試劑的酶。供試品中的螯合劑成分會螯合試劑中的二價陽離子（如Mg2+離子），造成抑制常見的螯合劑有：EDTA、檸檬酸鈉、肝素鈉、喹諾酮類藥物等12解決螯合問題1用BET水對供試品在允許的范圍內進行稀釋2使用含Mg2+或Ca2+離子的稀釋劑稀釋樣品，降低活性螯合劑含量3注意過高的二價陽離子（如Ca2+）濃度可能會帶來抑制13高滲透壓問題較高濃度的糖或者鹽通常會抑制鱟試劑反應，如50%葡萄糖或5%氯化鈉溶液。高滲透壓的溶液會從鱟試劑吸水，從而使酶失活，造成抑制使用BET水在允許范圍內進行稀釋可消除干擾14酶、酶抑制劑問題鱟試劑的凝固酶屬于一種絲氨酸蛋白酶，供試品中若含有類似的絲氨酸蛋白酶（常見于血液制品）會導致鱟試劑的反應，造成增強一些人血漿制品（如人血白蛋白、靜注用IgG等），作為原料的血漿和血清中的絲氨酸蛋白酶抑制劑會抑制LAL凝固酶與內毒素的反應活性，造成抑制通常來說較為簡易的一種消除干擾的方法是：使用BET水稀釋10倍，然后使用75℃加熱10分鐘15內毒素聚集問題提純的內毒素沒有自然存在的內毒素穩(wěn)定，其穩(wěn)定性沒有環(huán)境內毒素強內毒素分子的兩親性使其容易自身聚集成團，成為更大的分子，效價也會下降16解決內毒素聚集問題1如果內毒素標準品溶液需要儲存，必須驗證其儲存條件是否會影響其活性2經(jīng)常旋渦混合含有標準內毒素的溶液17脂質體問題脂多糖的兩親性會使其對一些具有疏水基團的產品具有親和力（如脂類、磷脂、脂蛋白、大分子量血漿蛋白）。脂多糖與這些特定產品的結合后會使其的大小和形狀受到影響，以至于影響活性，使得內毒素試驗受到干擾。使用內毒素分散劑稀釋樣品可以使內毒素從供試品中分離出來，恢復內毒素的活性18內毒素吸附問題一些試驗器具會對內毒素有吸附作用首選硼硅酸玻璃，第二聚苯乙烯材料不要用聚丙烯材料，它會加劇內毒素的損耗（吸附）提防塑料包裝溶出物帶來的干擾19非內毒素反應物（TAL-RM）β-葡聚糖是造成鱟試驗結果假陽性的一個已知來源用抗增液復溶鱟試劑可以消除大多數(shù)的葡聚糖干擾不同廠家的鱟試劑配方不同，請使用專用的抗增液，不要隨意混用20USP關于β-葡聚糖的描述USP的細菌內毒素檢查法要求：

“除了內毒素，鱟試劑還與某些β-葡聚糖反應。一些經(jīng)處理而制備的鱟試劑不會與β-葡聚糖反應，應使用這種鱟試劑檢測含葡聚糖的樣品”210.1mg/ml葡聚糖（抗增液）不存在干擾0.1mg/ml葡聚糖出現(xiàn)明顯的增強22提防洗滌劑（表面活性劑）！需要注意，無論是生產工藝上使用到的洗滌劑（或表面活性劑），還是器具上殘留的洗滌劑都會對鱟試驗造成干擾高濃度的洗滌劑使鱟試劑的蛋白變性，失去活性某些洗滌劑（如脫氧膽酸鈉）會將內毒素分散為脂多糖的單體（約20,000道爾頓），這些單體是無毒性并且不會激活鱟試劑的，但去除洗滌劑（如透析）后，內毒素活性恢復弱的非離子型表面活性劑（如吐溫20或吐溫80等）和其它陽離子型洗滌劑會分解內毒素的三維結構，使內毒素變成較小分子，從而增加其效價2