基因工程的基本操作程序課件

基因工程的基本操作程序1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞操作過(guò)程目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程的基本操作程序（1）編碼蛋白質(zhì)的基因：包括結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。（2）沒(méi)有翻譯產(chǎn)物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。（3）不能轉(zhuǎn)錄的DNA片段：如操縱基因?；虻姆N類(lèi)目的基因的獲取基因工程的基本操作程序非編碼區(qū)編碼區(qū)下游終止子編碼區(qū)上游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)非編碼區(qū)編碼區(qū)啟動(dòng)子啟動(dòng)子：基因首端,與RNA聚合酶結(jié)合,起始轉(zhuǎn)錄。終止子：基因尾端,阻止RNA聚合酶移動(dòng)，使轉(zhuǎn)錄終止。原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)基因工程的基本操作程序能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動(dòng)子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)基因工程的基本操作程序(一)、目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的基因（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫(kù)中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成目的基因的獲取基因工程的基本操作程序1.基因文庫(kù)：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。2.基因文庫(kù)的分類(lèi):按外源DNA片段的來(lái)源分類(lèi)基因組DNA文庫(kù)：含有一種生物的全部基因種類(lèi)部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)從基因文庫(kù)中直接獲取基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序（一）基因文庫(kù)的構(gòu)建（1）基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫(kù)（每個(gè)受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成與載體連接導(dǎo)入受體菌群mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA(cDNA)該生物cDNA文庫(kù)基因工程的基本操作程序1、概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因，又叫做體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段2、原理：DNA復(fù)制利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因基因工程的基本操作程序4、條件：模板DNA(需含有目的基因)

四種脫氧核苷酸(dNTP)

熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）溫度控制引物：與目的基因的起始段互補(bǔ)3、前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物PCR基因工程的基本操作程序IMN變性復(fù)性延伸PCR基因工程的基本操作程序5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G變性復(fù)性延伸1、變性(90---95度)：目的基因DNA受熱變性，解鏈為單鏈；2、復(fù)性（55---60）：引物與兩條單鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合；3、延伸（70---75）：在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，從5′端→3′端進(jìn)行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ5、擴(kuò)增過(guò)程PCR基因工程的基本操作程序PCR技術(shù)擴(kuò)增過(guò)程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，從引物的______________________延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈5′端→3′端基因工程的基本操作程序DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)合成

當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測(cè)得或核苷酸序列已知時(shí)，可采用此種方法。DNA合成儀化學(xué)方法人工合成基因工程的基本操作程序1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________?！?/p>

核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的基本操作程序質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA基因工程的基本操作程序基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶

目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。基因工程的基本操作程序

科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，經(jīng)過(guò)了許多復(fù)雜的過(guò)程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲(chóng)基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲(chóng)基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力。資料:基因工程的基本操作程序基因表達(dá)載體的組成：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因基因工程的基本操作程序基因工程載體的構(gòu)建需要考慮哪些因素

（1）基因的特點(diǎn)：如果一個(gè)來(lái)自動(dòng)物的目的基因含有內(nèi)含子，就不能用于轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)閯?dòng)物中內(nèi)含子的剪接系統(tǒng)與植物的不同，植物不能將動(dòng)物基因的內(nèi)含子剪切掉，只能用該基因的cDNA?；虻漠a(chǎn)物如果是一個(gè)糖蛋白，那么該基因在原核生物細(xì)菌中表達(dá)出來(lái)的蛋白就可能不具備天然狀態(tài)下的活性，因?yàn)樘堑鞍咨系奶擎準(zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加上的，而細(xì)菌無(wú)這些細(xì)胞器。（2）要選擇強(qiáng)啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子有強(qiáng)有弱，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子可以增加轉(zhuǎn)錄活性，使基因產(chǎn)物量增多。如果希望基因在生物的某個(gè)組織表達(dá)，如只在植物種子中表達(dá)，就要選擇種子中特異表達(dá)的啟動(dòng)子。（3）要有選擇標(biāo)記基因，如抗生素基因，以便選擇出真正的轉(zhuǎn)基因生物?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蛑参锛?xì)胞：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；基因槍法；花粉管通道法動(dòng)物細(xì)胞：顯微注射法；微生物：Ca2+處理法。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞基因工程的基本操作程序農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法——采用最多農(nóng)桿菌特點(diǎn)：感染雙子葉植物和裸子植物；其Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體的DNA上。過(guò)程：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的DNA表達(dá)受體細(xì)胞（植物細(xì)胞）基因工程的基本操作程序基因槍法——單子葉常用利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將金屬顆粒打入受體細(xì)胞，其表面包裹有表達(dá)載體DNA，進(jìn)而目的基因與受體細(xì)胞基因整合并表達(dá)。基因工程的基本操作程序

花粉管通道法——中國(guó)獨(dú)創(chuàng)，抗蟲(chóng)棉花粉形成的花粉管還未融合前，剪去柱頭，滴加DNA，使目的基因借助花粉管進(jìn)入受體細(xì)胞?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蝻@微注射法過(guò)程：將含有目的基因的表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射胚胎發(fā)育獲得具有新性狀的個(gè)體受體細(xì)胞（動(dòng)物細(xì)胞）基因工程的基本操作程序Ca2+處理過(guò)程：Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA受體細(xì)胞（微生物細(xì)胞）基因工程的基本操作程序目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)與鑒定的目的目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性檢測(cè):分子水平是否插入目的基因——DNA水平是否轉(zhuǎn)錄——RNA水平是否翻譯——蛋白質(zhì)水平鑒定:個(gè)體水平

抗性、天然活性基因工程的基本操作程序檢測(cè)目的基因是否插入了轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)分子水平的檢測(cè)——分子雜交技術(shù)探針DNA——DNA探針DNA——RNA抗原——抗體目的基因(DNA，Pr)