《分離特定的微生物并測(cè)定其數(shù)量》復(fù)習(xí)課件

第二節(jié)分離特定的微生物并測(cè)定其數(shù)量3．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作唯一氮源的選擇培養(yǎng)基分離該細(xì)菌。4．鑒定分解尿素細(xì)菌的方法是在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，據(jù)是否變紅進(jìn)行判斷。1.測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。2．稀釋涂布平板法常用來(lái)統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)目但統(tǒng)計(jì)結(jié)果往往比活菌數(shù)目低。1．篩選菌株的思路(1)自然界中目的菌株的篩選：①依據(jù)：根據(jù)它對(duì)

的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。②實(shí)例：PCR技術(shù)過(guò)程中用到的耐高溫的

，就是從熱泉中篩選出來(lái)的Taq細(xì)菌中提取出來(lái)的。生存環(huán)境TaqDNA聚合酶(2)實(shí)驗(yàn)室中目的菌株的篩選：①原理：人為提供有利于

生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)

其他微生物的生長(zhǎng)。②方法：利用選擇培養(yǎng)基分離。a．選擇培養(yǎng)基：允許

微生物生長(zhǎng)，同時(shí)阻止或選擇其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。b．實(shí)例：選擇分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基，以

作為唯一氮源，只有能合成

的微生物才能分解尿素。目的菌株抑制或阻止特定尿素脲酶②計(jì)數(shù)原則：一般選擇菌落數(shù)在

的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。③結(jié)果分析：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目

。原因是當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是

。(2)其他方法：利用

直接計(jì)數(shù)。30～300低一個(gè)菌落顯微鏡1．選擇培養(yǎng)基的類型及作用(1)在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)。如加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌；加入高濃度的食鹽可得到金黃色葡萄球菌。(2)改變培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分。如培養(yǎng)基中缺乏氮源時(shí)，可以分離固氮微生物，因?yàn)榉枪痰⑸锊荒茉诖伺囵B(yǎng)基上生存。

(3)改變微生物的培養(yǎng)條件。如將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)只能得到耐高溫的微生物。2．統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目(1)稀釋涂布平板法：①原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。②注意事項(xiàng)：a．設(shè)置重復(fù)組：同一稀釋度下，至少涂布3個(gè)平板作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。分析結(jié)果時(shí)，需考慮重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。b．設(shè)置對(duì)照：目的是排除實(shí)驗(yàn)中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)的可信度。特別提醒：教材中的實(shí)例說(shuō)明了設(shè)置重復(fù)組的重要性。第一位同學(xué)只涂布了1個(gè)平板，沒(méi)有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說(shuō)服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問(wèn)題，涂布了3個(gè)平板，但是，其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)值結(jié)果與另2個(gè)相差太遠(yuǎn)，說(shuō)明在操作過(guò)程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，不能簡(jiǎn)單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來(lái)求平均值。③計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)＝(C÷V)×M。C：代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。V：代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積。M：代表稀釋倍數(shù)。(2)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法：①原理：此法利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量。②缺點(diǎn)：不能區(qū)分細(xì)菌的死活。③方法：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，上面有一個(gè)特定的面積為1mm2和高為0.1mm的計(jì)數(shù)室，在1mm2的面積里又被劃分成25個(gè)(或16個(gè))中格，每個(gè)中格進(jìn)一步劃分成16個(gè)(或25個(gè))小格，但計(jì)數(shù)室都是由400個(gè)小格組成的。如圖所示。④計(jì)算公式：每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)。例題：下表是培養(yǎng)分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基配方，請(qǐng)回答下面的問(wèn)題：編號(hào)成分含量①KH2PO41.4g

②Na2HPO42.1g

③MgSO4·7H2O0.2g

④葡萄糖10.0g

⑤尿素1.0g

⑥瓊脂15.0g

將上述物質(zhì)溶解后，用自來(lái)水定容到1000mL(1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物提供碳源的是________，提供氮源的是________。(2)絕大多數(shù)微生物都能利用________，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解________。(3)分析該培養(yǎng)基的配方，該培養(yǎng)基對(duì)微生物是否具有選擇作用？如果具有，又是如何進(jìn)行選擇的？答案：(1)葡萄糖尿素(2)葡萄糖尿素(3)該培養(yǎng)基對(duì)微生物具有選擇作用。以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基可以分離得到產(chǎn)生脲酶的微生物(即分解尿素的微生物)。解析：碳源是提供碳元素的物質(zhì)，氮源是提供氮元素的物質(zhì)，所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。該培養(yǎng)基的配方中含有凝固劑——瓊脂，所以，配制的一定為固體培養(yǎng)基。絕大多數(shù)生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以這種培養(yǎng)基對(duì)微生物有選擇作用。選擇的原理是只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長(zhǎng)。有機(jī)質(zhì)中性3～8cm30～300溫度時(shí)間數(shù)目穩(wěn)定(4)計(jì)數(shù)：當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，取同一

下的3個(gè)平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，求出

，并根據(jù)所對(duì)應(yīng)

計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目稀釋度平均值稀釋度2．菌種鑒定(1)原理：分解尿素的細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解為

，使培養(yǎng)基的

增強(qiáng)。

(2)方法：在以

為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入

指示劑培養(yǎng)細(xì)菌，若指示劑變

，可確定該種細(xì)菌能夠分解尿素。氨堿性尿素酚紅紅1．當(dāng)?shù)谝淮螠y(cè)定時(shí)為什么要將稀釋范圍放寬一些？提示：為確保能從中選擇出菌落數(shù)在30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。2．為什么要選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果？提示：防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。1．操作中的注意事項(xiàng)(1)無(wú)菌操作：鐵鏟和信封都要滅菌。稱取土壤、將稱好的土樣倒入錐形瓶、稀釋土壤溶液，每一步都要在酒精燈的火焰旁進(jìn)行。(2)做好標(biāo)記：如在培養(yǎng)皿上注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期以及培養(yǎng)樣品的稀釋度等。2．結(jié)果分析與評(píng)價(jià)(1)培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落：對(duì)照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基沒(méi)有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說(shuō)明