葡萄糖氧化酶及其應(yīng)用

葡萄糖氧化酶及其應(yīng)用【摘要】:葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶,對人體無毒、副作用，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)中，起到了去除葡萄糖、脫氧、殺菌等作用。該文從葡萄糖氧化酶的性質(zhì)、生產(chǎn)和應(yīng)用等方面對其進行了簡單介紹。【關(guān)鍵詞】：葡萄糖氧化酶性質(zhì)生產(chǎn)應(yīng)用TheglucoseoxidaseanditsapplicationAbstract:Glucoseoxidase(GOD)isanaerobicdehydrogenase.Ithasnosideeffectsandnon-toxicityonhuman.GOX，whichhasplayedanimportantroleonremovingglucose，de-oxidizationandsterilization，iswidelyapplicatedinfood,medicine,feedstuffandotherfields.Thispaperreviewstheproperty,productionandapplicationofGlucoseoxidase.KeyWords:Glucoseoxidasepropertyproductionapplication葡萄糖氧化酶（GlucoseoxidaseEC1.1.3.4.）全稱為β-D-吡喃型葡萄糖需氧脫氫酶，簡稱GOD，它能在有氧的條件下專一性將β-D-葡萄糖氧化為葡萄糖酸和過氧化氫。早在1904年，人們就發(fā)現(xiàn)了葡萄糖氧化酶，但當(dāng)時對其商業(yè)價值認識的不足，并未引起人們的重視。直到1928年，Muller首先從黑曲霉的無細胞提取液中發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶，并進一步通過試驗確定了酶的作用機理，并命名為葡萄糖氧化酶，之后把他歸入脫氫酶類。葡萄糖氧化酶廣泛的存在于動物、植物和微生物體內(nèi)，微生物繁殖快，來源廣的特點事其成為葡萄糖氧化酶的主要來源，主要生產(chǎn)菌株為黑曲霉和青霉。其廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)中，起到了去除葡萄糖、脫氧、殺菌等作用。產(chǎn)量低、酶活低、檢測方法復(fù)雜是GOD產(chǎn)業(yè)化的限制性因素。國外由于對葡萄糖氧化酶的研究較早，在菌種篩選、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化、酶的分離純化、酶學(xué)特性以及葡萄糖氧化酶基因的克隆與表達等方面研究都已較為深入。相比國外，我國對葡萄糖氧化酶的研究工作起步較晚，從20世紀(jì)末期對其展開了較為系統(tǒng)的研究。我國受技術(shù)水平以及儀器設(shè)備的限制，目前生產(chǎn)的工業(yè)酶制劑不僅生產(chǎn)成本高，而且純度以及穩(wěn)定性方面都達不到要求，工業(yè)酶制劑市場基本被國外企業(yè)所壟斷，而如何降低葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)成本和提高其應(yīng)用適應(yīng)性是急待解決的問題[1]。1.葡萄糖氧化酶的性質(zhì)1.1物理性質(zhì)粉狀的葡萄糖氧化酶呈灰黃色，液狀的葡萄糖氧化酶為淡褐色，精制液體狀酶為淡黃色。易溶于水，不溶于不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有機溶劑，50%丙酮和66%甲醇能沉淀該酶，溶液在搖動時泡沫呈棕綠色，不能透過硝化纖維膜。固體葡萄糖氧化酶在0℃條件下至少能保存2年，在-15℃下可保存8年[2]。1.2化學(xué)性質(zhì)葡萄糖氧化酶相對分子質(zhì)量一般在1.5×105左右，每分子酶含2分子FAD。pH作用范圍3.5~6.5，最適pH為5.0左右，在沒有保護劑存在的條件下pH>8.0或pH<3.0時會迅速失活。葡萄糖氧化酶的作用溫度范圍一般為30～60℃，最適作用溫度為50～55℃。葡萄糖氧化酶能高度特異性的結(jié)合β-D-吡喃葡萄糖，葡萄糖分子C1上的羥基對酶的催化作用是必要的條件，而且羥基位于β-位時酶的活性比位于α-位時酶的活性高大約160倍。底物的分子結(jié)構(gòu)在C1、C2、C3、C4、C5、C6位上的改變使葡萄糖氧化酶的活性大幅度下降，但在不同的程度上還表現(xiàn)出一定的活性，見表1。葡萄糖氧化酶對于L-葡萄糖和2-O-甲基-D-葡萄糖是完全沒有活性的[3]。表1葡萄糖氧化酶的底物特異性葡萄糖改性的位置

化合物

同β-D-葡萄糖的差別

相對速率

β-D-葡萄糖

100

1

α-D-葡萄糖

C1上OH的構(gòu)型

0.64

續(xù)表1葡萄糖氧化酶的底物特異性葡萄糖改性的位置

化合物

同β-D-葡萄糖的差別

相對速率

2

2-脫氧-D-葡萄糖

C2上OH被H取代

3.3

曲霉米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、土曲霉（Aspergillusterreus）其他菌屬鐮刀霉屬(Fusarium)、檸檬酸霉屬(Citromyces)2.2利用菌株誘變獲得葡萄糖氧化酶對葡萄糖氧化酶生產(chǎn)菌株的誘變通常采用紫外誘變和化學(xué)誘變劑誘變等方法［6］。紫外線照射通過改變菌體DNA從而引起菌體的突變。李筱瑜等人[7]。將黑曲霉菌株P(guān)-采用紫外線進行誘變，得到突變菌株U-69產(chǎn)酶酶活是出發(fā)菌株P(guān)-的2.5倍.化學(xué)誘變是用化學(xué)誘變劑處理菌種，以誘發(fā)遺傳物質(zhì)的突變?；瘜W(xué)誘變相比于紫外誘變更具定向性，化學(xué)誘變劑不同，作用的菌株、細胞及基因不同，誘變的效果也會存在差異。常用的化學(xué)誘變劑有甲基磺酸乙酯(EMS)和硫酸二乙酯(DES)等[1]。選擇單獨一種誘變方法，也可以幾種方法復(fù)合使用，篩選出其中的正突變菌株，提高原始菌株產(chǎn)酶能力。2.3利用基因重組技術(shù)獲得葡萄糖氧化酶工業(yè)化生產(chǎn)中常用黑曲霉或青霉發(fā)酵來獲得葡萄糖氧化酶，但黑曲霉和青霉菌發(fā)酵過程中常會伴隨產(chǎn)生過氧化氫酶淀粉酶等其他雜蛋白，給后期的分離純化工作帶來困難，因此用基因工程方法構(gòu)建更優(yōu)良的葡萄糖氧化酶生產(chǎn)菌株一直受到各國科學(xué)家的注視。將葡萄糖氧化酶的基因進行克隆，連接相應(yīng)的表達載體后轉(zhuǎn)化基因工程菌株，通過誘導(dǎo)表達葡萄糖氧化酶基因來獲取大量的葡萄糖氧化酶蛋白。由于基因工程菌株分泌到基質(zhì)中的其本身內(nèi)源蛋白量很少，基質(zhì)中主要是基因工程菌株分泌到胞外的外源目的蛋白，因此能簡化后期的蛋白純化操作。目前國外主要用基因克隆、表達來提高菌株的產(chǎn)酶活力，在這一領(lǐng)域研究已經(jīng)比較深入。WhittingtonH成功地將青霉菌的GOD基因?qū)氲结劸平湍钢校@得了具有生物活性的；Szynol實現(xiàn)了葡萄糖氧化酶基因在大腸桿菌中的表達［8］；SilviaCrognale將一株青霉的葡萄糖氧化酶基因成功導(dǎo)入到畢赤酵母中，發(fā)酵培養(yǎng)酶活達到50U/ml;國內(nèi)在這一方面的研究也取得了一定的進展。母敬郁等[9]采用瑞氏木霉表達了黑曲霉來源的葡萄糖氧化酶基因，經(jīng)過對重組后的瑞氏木霉進行誘變篩選，突變株的葡萄糖氧化酶發(fā)酵液酶活達到25U/ml。目前已有多種外源基因表達系統(tǒng)被開發(fā)出來，如大腸桿菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)等大腸桿菌表達系統(tǒng)雖然發(fā)展較為成熟，操作簡單、周期短、產(chǎn)量高，但其表達產(chǎn)物無翻譯后的修飾與加工過程，不能對蛋白質(zhì)進行翻譯，酵母繁殖速度快、易于培養(yǎng)、基因工程操作簡便，并能夠?qū)δ康牡鞍走M行翻譯后加工與修飾，越來越廣泛地用作外源基因表達的宿主菌株［1］。雖然目前利用基因工程的手段實現(xiàn)了葡萄糖氧化酶的異源表達，但是由于表達量不高導(dǎo)致的生產(chǎn)成本高的問題仍然沒有得到有效的解決，阻礙了葡萄糖氧化酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。因此如何采用基因工程技術(shù)實現(xiàn)葡萄糖氧化酶基因的高效表達，使葡萄糖氧化酶的產(chǎn)量得到大幅度的提高成為了亟待解決的關(guān)鍵問題。3.葡萄糖氧化酶的應(yīng)用葡萄糖氧化酶由于具有催化專一性、高活性和催化高效性，對人體無毒副作用等優(yōu)點被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥、飼料添加等方面。其最主要的用途是生產(chǎn)葡萄糖酸及作為抗氧化劑而廣泛用于食品保鮮過程中。3.1葡萄糖氧化酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用目前葡萄糖氧化酶在食品工業(yè)中主要應(yīng)用在以下五個方面：脫氧、改良面粉、去葡萄糖、測定葡萄糖含量、殺菌。3.1.1脫氧葡萄酒、啤酒、果汁、奶粉等食品常常出現(xiàn)變色、渾濁、沉淀等現(xiàn)象，影響了產(chǎn)品的品質(zhì)究其原因是因為氧氣氧化了其中的還原性物質(zhì)如黃酮、亞油酸、亞麻酸等。GOD可快速高效地去除食品中的氧氣，保護食品中還原性物質(zhì)不被氧化破壞，達到脫氧保鮮的效果[10]。在啤酒生產(chǎn)中，氧氣的存在一方面會導(dǎo)致啤酒的色澤加深、氧化變質(zhì)，同時氧氣又為微生物的生長提供了便利條件，降低保存期，通過添加無毒副作用的葡萄糖氧化酶可以將葡萄糖氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯，葡萄糖酸內(nèi)酯性質(zhì)較穩(wěn)定，沒有酸味、無毒副作用，對啤酒的質(zhì)量沒有什么影響，而且不具有氧化能力。并且反應(yīng)在消耗氧氣的同時產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫本身就是一種殺菌劑，可以抑制微生物的生長，氧氣的消耗減緩了啤酒的氧化變質(zhì)過程，有效防止啤酒老化，明顯降低啤酒濁度，改善啤酒的風(fēng)味，延長啤酒的保質(zhì)期。葡萄糖氧化酶的價格適宜,添加量少,每瓶啤酒只需加入10單位葡萄糖氧化酶,可使總氧從2.5mg/L降為0.05mg/L,去氧達98%,去氧效果之佳為其他同類產(chǎn)品所無法比擬。每瓶啤酒(640mL)成本才人民幣0.003元。不需要增添任何設(shè)備,不需改變原生產(chǎn)工藝,使用方便,適合大生產(chǎn)使用。在酸奶和各種發(fā)酵乳的生產(chǎn)中，添加GOD消耗掉氧氣，延緩產(chǎn)品氧化變質(zhì),乳酸菌采用厭氧發(fā)酵，GOD的加入不會影響功能性乳制品中的益生菌，同時能抑制好氧雜菌的生長，提升了乳制品的品質(zhì)和風(fēng)味［11］.在水果貯存中,GOD脫除氧氣，水果的非酶褐變得到抑制，水果的品質(zhì)及儲存期都得到改善。3.1.2改良面粉葡萄糖氧化酶是面粉改良劑與面包品質(zhì)改良劑。傳統(tǒng)的小麥粉強筋劑以溴酸鉀的應(yīng)用最為普遍，但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)溴酸鉀能夠使動物組織致癌，不利于人體健康。目前，GOD作為面粉改良劑溴酸鉀的替代品，已經(jīng)用作一種更為安全的面粉改良劑［12］。改良面粉的原理是，GOD催化β-D-葡萄糖生成過氧化氫，而面筋蛋白中的巰基(-SH)在過氧化氫的作用下被氧化形成二硫鍵(-S-S-)，而二硫鍵的形成有助于面團的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成；同時面粉中過氧化物酶作用于過氧化氫產(chǎn)生自由基，促進戊聚糖的氧化交聯(lián)反應(yīng)，有利于可溶性戊聚糖氧化凝膠形成較大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增強了面團的彈性在這個過程中需要控制GOD的添加量，否則多余的酶不利于強筋作用。GOD在面包焙烤中能夠改善耐機械攪拌性、入爐急漲特性等影響面包品質(zhì)的關(guān)鍵因素，使面團更加穩(wěn)定，增大面包體積，增加彈性，改善面包的外形和口感。3.1.3去葡萄糖食品加工工藝中部分糖蛋白分解后，還原糖的醛基和氨基酸的羧基會產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，使產(chǎn)品褐變，破壞產(chǎn)品品質(zhì)，全球每年因為美拉德反應(yīng)造成的食物浪費都很巨大。GOD能將葡萄糖分子上的醛基轉(zhuǎn)變?yōu)轸然?，消除美拉德反?yīng)，從而抑制食品的非酶褐變，保持產(chǎn)品的色澤和溶解性。將GOD添加到蛋白粉、果醬制品等糖含量較高的食品中，能除去葡萄糖，抑制產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生的褐變。同時由于葡萄糖含量降低，微生物生長受到抑制，產(chǎn)品的貨架期得以延長[12]。3.1.4葡萄糖的定量分析酶的專一性的特點，使得GOD可用于測定各種食品和混合物中葡萄糖含量。目前用固定化技術(shù)制成的GOD分析儀已用于測定發(fā)酵液的殘?zhí)橇?，該方法簡單、快速、?zhǔn)確,真正起到了指導(dǎo)生產(chǎn)的作用。據(jù)此原理制成的葡萄糖測定試劑盒，可定量測定果汁、飲料及牛奶等多種食品中葡萄糖的含量。3.1.5殺菌由于葡萄糖氧化酶的脫氧作用，消耗氧氣，從而有效的抑制了好氧微生物的生長繁殖，同時產(chǎn)生的過氧化氫本身就是一種殺菌劑。在實際的生產(chǎn)應(yīng)用中，常將過氧化氫酶與葡萄糖氧化酶組成酶系添加于食品中，這樣既能利用過氧化氫的殺菌作用，同時由于過氧化氫酶的存在能去除殘留在食品中的過氧化氫，不僅延長食品的保質(zhì)期，對食品的品質(zhì)也不會造成影響。GOD相比于其他化學(xué)抑菌劑的優(yōu)勢在于其作為生物制劑安全性更高，添加于食品中更加安全放心。3.2葡萄糖氧化酶在吃飼料行業(yè)中的應(yīng)用葡萄糖氧化酶是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)飼糧消化，促進動物生長。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預(yù)防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進動物生長作用。由于葡萄糖氧化酶能催化腸道內(nèi)的葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸和過氧化氫，當(dāng)過氧化氫積累到一定濃度時，直接抑制大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、葡萄球菌、弧菌的生長繁殖。其作用機理完全不同于抗生素，不會產(chǎn)生菌體抗藥性或藥物殘留。葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖去除腸道內(nèi)氧氣，為厭氧有益菌雙歧桿菌的增殖制造厭氧環(huán)境。生成的葡萄糖酸可降低胃腸內(nèi)pH值，為乳酸菌生長制造酸性環(huán)境。有益菌大量增殖形成微生態(tài)競爭優(yōu)勢，不利于大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的存活，控制感染，排除腐敗物質(zhì)，提高巨噬細胞活性，從而提高機體免疫力。葡萄糖氧化酶可以作為單一酶制劑，添加到動物的基礎(chǔ)日糧中，也可與其它功能成分組成復(fù)合添加劑，如飼用動物腸道保護劑、飼用動物營養(yǎng)補充劑、飼料霉菌毒素脫除劑等。其作為一種新型綠色的飼料酶制劑，已被廣泛應(yīng)用于雞用配合飼料、豬用配合飼料、牛羊配合飼料以及其他配合飼料，然而由于微生物發(fā)酵制備高產(chǎn)高活葡萄糖氧化酶還存在一定困難，從而制約了葡萄糖氧化酶在我國飼料工業(yè)中的規(guī)模化應(yīng)用[13]。3.3葡萄糖氧化酶在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用葡萄糖氧化酶和乳酸過氧化物酶（LPO）、淀粉葡糖苷酶、葡聚糖酶、溶菌酶等酶制劑可除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成。含有葡萄糖氧化酶的藥物，其穩(wěn)定性提高3倍。含有GOX、LPO和含碘化合物等成分的制劑，可用于口腔衛(wèi)生除口臭，并具有抗頭皮屑的作用。含GOX和LPO的雙酶口香糖，在咀嚼時抑菌有效率達96%99%。GOX可用于對H2O2敏感的淋巴瘤的導(dǎo)向目標(biāo)的治療。作為試劑盒、酶電極等用于血清（漿）、尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析[4]。4、葡萄糖氧化酶的發(fā)展前景葡萄糖氧化酶是一種綠色、安全的酶制劑，在食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。但目前規(guī)模化生產(chǎn)高活性的葡萄糖氧化酶還有困難。發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的同時產(chǎn)生大量雜蛋白，分離提取復(fù)雜，成本高。國內(nèi)葡萄糖氧化酶產(chǎn)量與國外報道的最高產(chǎn)量120U/mL尚有差距，有待提高。酵母菌的基礎(chǔ)研究較透徹，生長代謝速度快，是目前最有潛力的改造菌株，但基因工程構(gòu)建菌株耗資大，菌株易退化，工業(yè)生產(chǎn)還有難度。利用葡萄糖氧化酶延長食品的保質(zhì)和保鮮期是非常有潛力的課題。葡萄糖氧化酶在動物體內(nèi)的作用方式、最佳作用條件、代謝過程有待研究。如何更經(jīng)濟、更有效地制備和提純葡萄糖氧化酶也是今后研究的方向。隨著研究的不斷深入，葡萄糖氧化酶的應(yīng)用前景將會更加廣闊。參考文獻：[1]朱運平，伍少明，李秀婷，等.微生物葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)及其在食品工業(yè)中應(yīng)用的研究進展[J].中國食品添加劑，2013（5）：165-172.[2]劉超，袁建國，王元秀，等·葡萄糖氧化酶的研究進展[J]·食品與藥品，2010,12（07）：285—289[3]何慶國，丁立孝主編·食品酶學(xué)·北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006[4]李艷，李靜·葡萄糖氧化酶及其應(yīng)用[J]·食品工程，2006（3）：9-11.[5]朱運平，伍少明，李秀婷等.微生物葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)及其在食品工業(yè)中應(yīng)用的研究進展[J]中國食品添加劑，2013（5）：165-172.[6]RayS,BnaikAK.EffectofammoniumandnitrateratioonglucoseoxidaseactivityduringgluconicacidfermentationbyamutantstrainofAspergillusniger[J].IndianJ.Exp.Biol.1999,37(4):391-395.[7]梁靜娟，李筱瑜，官威，等.產(chǎn)葡萄糖氧化酶黑曲霉的誘變選育及葡萄糖酸鈣發(fā)酵條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(12):218-220.[8]SzynolA,SoetD,TuylE.Bactericidaleffectsofafusion