醫(yī)學(xué)課件體外放射分析

體外放射分析

Invitroradioassay放射免疫分析免疫放射分析放射受體分析受體放射分析競爭性蛋白質(zhì)結(jié)合分析放射性酶學(xué)分析等ZhangYongxue體外放射分析定義

是指在體外條件下，以放射性核素標(biāo)記的配體為示蹤劑以結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)以放射性測量為定量手段對微量物質(zhì)進行定量分析的一類分析方法的總稱。主要方法放射免疫分析、免疫放射分析、放射受體分析、受體放射分析、蛋白質(zhì)競爭結(jié)合分析等。其中以放射免疫分析和免疫放射分析應(yīng)用最為普遍。不僅可用于樣品中蛋白質(zhì)、多肽、甾體類激素等物質(zhì)的測量，而且可用于具有生物活性的小分子物質(zhì)的檢測，如血藥濃度測定等?；驹砀偁幮越Y(jié)合分析放射免疫分析是體外放射分析最有代表性的一類檢測技術(shù)。放射免疫分析的基本原理是以抗原及其特異性抗體在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)體系中能夠發(fā)生免疫反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物為基礎(chǔ)的。

K1Ag+AbAg.AbK2

K1=Ag、Ab正向結(jié)合為Ag.Ab復(fù)合物的速率常數(shù)；

K2=Ag.Ab復(fù)合物離解為Ag和Ab的速率常數(shù)；K1在早期明顯，K2在后期明顯，一定時間后達到平衡狀態(tài)，兩者保持相對恒定，但K1>K2。K1與K2之比為親和力常數(shù)，Ka=K1/K2，K越大越好。K2與K1之比為平衡離解常數(shù)，Kd=K2/K1。放射免疫分析為了定量地測定待測樣品中抗原的含量，如在這個體系中加入放射性核素標(biāo)記的同類抗原，體系中同時存在兩個平衡。

Ag＋AbAg.Ab＋

Ag*

Ag*.Ab分析原理Ag*與Ag由于免疫化學(xué)性質(zhì)一致，共同競爭性與Ab結(jié)合，當(dāng)Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*與Ag之和大于Ab時，則Ag*.Ab復(fù)合物的形成受Ag含量的制約，二者之間存在函數(shù)關(guān)系，即隨著Ag濃度的增加，Ag*.Ab復(fù)合物也減少，因為Ag*對Ab的結(jié)合被Ag競爭性抑制。競爭性結(jié)合分析條件Ag*與Ag的免疫化學(xué)性質(zhì)相同；Ag*與Ag之和大于Ab，Ag*與Ab的量保持恒定。結(jié)合率抗體稀釋度50%50％的最大結(jié)合率為抗體工作濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如果采用系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下進行分析，測得各標(biāo)準(zhǔn)點的結(jié)合率(B/F)，以結(jié)合率對標(biāo)準(zhǔn)品量作圖，可以得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過這條標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查得未知濃度的待測樣品的含量。

B/F已知Ag濃度非競爭性分析免疫放射分析是典型的非競爭性體外放射分析。它應(yīng)用標(biāo)記抗體作為示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過量的標(biāo)記抗體、待測物（或標(biāo)準(zhǔn)品）進行全量反應(yīng)，未結(jié)合的標(biāo)記抗體通過加入免疫吸附劑而去掉，因此，溶液中放射性與待測物的濃度呈正相關(guān)?；绢愋鸵钥乖贵w間的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)是以抗原抗體的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，利用待測抗原與定量的標(biāo)記抗原同有限量的特異性抗體競爭性結(jié)合，以放射性測量為微量定量手段，獲得待測生物樣品中抗原濃度的技術(shù)。免疫放射分析

免疫放射分析(Immunoradiometricassay,IRMA)也是以抗原抗體的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，不同的是放射性核素標(biāo)記的是抗體，以過量標(biāo)記抗體直接與待測抗原結(jié)合。為非競爭性結(jié)合分析。

Ag＋Ab*(過量)===Ag.Ab*＋Ab*(1)單位點法：Ag＋Ab*(過量)Ag.Ab*＋Ab*(加抗原吸附劑去除多余Ab*，上清為結(jié)合部分)。

雙位點法(Ab2為McAb)具有代表性的固相免疫放射分析法：固相Ab1(試管壁上)+Ag(固相)Ab1.Ag

(過量)+過量Ab*2((McAb)固相Ab1.Ag.Ab*2+剩余Ab*(洗去)

雙位點法(Ab1為McAb)固相Ab1-McAb(試管壁上)+Ag(固相)Ab.Ag(過量)+

Ab*2(過量)

固相Ab1.Ag.Ab*2+剩余Ab*(洗去)

最后抗原被夾在兩種抗體分子之間，測固相上的放射性(結(jié)合部分)。此法過量標(biāo)記抗體易去除,NSB較低，靈敏度高；抗原結(jié)合部分需要有兩個特定的抗原決定簇，故特性較高。標(biāo)記第三抗體法與雙位點法相似，只是兩種抗體均不標(biāo)記，而是反應(yīng)結(jié)束后，加入非特異的125I-第三抗體(兔抗鼠IgG)，與抗原－抗體復(fù)合物結(jié)合，達到測量結(jié)合部分的目的。RIA與IRMA的異同均為以抗原抗體的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，測定對象為物質(zhì)的抗原；RIA

☆為競爭性，標(biāo)記物為抗原

☆結(jié)合部分放射性與待測抗原濃度呈負(fù)相關(guān),在直角坐標(biāo)系呈曲線

☆為了產(chǎn)生競爭,抗體僅使用結(jié)合50%抗原的量,故靈敏度較免放法低IRMA為非競爭性，標(biāo)記的是抗體，且為過量（高滴度）結(jié)合部分放射性與待測抗原濃度呈正相關(guān)，因抗體為過量，不存在競爭結(jié)合，故結(jié)合在固相物上的放射性計數(shù)與抗原濃度呈正比，在直角坐標(biāo)系近似直線；但當(dāng)待測抗原濃度超過一定范圍時，則正比關(guān)系消失，出現(xiàn)“平臺效應(yīng)。濃度過高出現(xiàn)的平臺效應(yīng)

被測物質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的有效范圍結(jié)合率（%）

因抗體為過量，抗原全量參與反應(yīng)，反應(yīng)更為迅速，靈敏度高標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍大由于使用單抗，其特異性好免疫放射分析僅適用于多肽和蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)的測定，要求抗原不少于兩個以上的抗原決定簇（通常一個抗原決定簇至少由5-6個氨基酸組成，故理論上少于10個以下氨基酸的小分子物質(zhì)無法建立免放分析法）

因使用固相法，操作更簡便，易于分離（固相材料有多種）標(biāo)記抗體比標(biāo)記抗原容易,可獲得高比度的抗體。

以配體與受體間的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)放射受體分析放射受體分析(Radioreceptorassay,RRA)也是競爭性結(jié)合分析法。與放射免疫分析不同的是以特異性受體蛋白質(zhì)取代抗體。利用待測配體及定量的標(biāo)記配體與有限量的特異性受體蛋白質(zhì)競爭性結(jié)合，測得樣品中配體的濃度。反應(yīng)原理

Ligand+ReceptorL.R+

L*

L*.R受體放射分析受體放射分析(receptorradioassay)是以分析受體的數(shù)量和性質(zhì)為目的一定量受體只能與一定量的標(biāo)記配體（受體激動劑和阻斷劑）結(jié)合，受體具有一定的飽和度根據(jù)復(fù)合物的最大放射性及所用標(biāo)記配體的比活度推算出受體的數(shù)量，并利用scatchard作圖法求出受體的親和力常數(shù)，以反映受體的性質(zhì)等。

L*+R===L*.R+L*受體容量分析已知量

配體123B%受體受體容量(mol)兩者比較相同點都是標(biāo)記配體，配體與受體的結(jié)合反應(yīng)，反映生物活性。不同點前者測配體含量，后者測受體容量，前者為競爭性，后者為飽和分析。

以酶與底物間的酶促反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法主要有兩類方法放射酶分析法：以酶為結(jié)合劑，測量配體的含量；酶的放射化學(xué)測定：以放射性標(biāo)記的底物為配體，測定酶的活性。

競爭性蛋白質(zhì)結(jié)合分析基本技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)品

質(zhì)的要求與待測配體屬同類物質(zhì)與待測配體有同等的活性和親和能力純度高，不含其它雜質(zhì)、穩(wěn)定性好

量的要求

定量精確標(biāo)記品合適的核素標(biāo)記（半衰期、射線類型、能量等）標(biāo)記物的用量要小，應(yīng)等于或低于待測物的最小量足夠的比活度放化純度高免疫活性穩(wěn)定性好，貯存不易脫標(biāo)特異性結(jié)合劑抗體、受體、酶、蛋白質(zhì)特異性(specificity)：不受交叉反應(yīng)的程度親和力(affinity)：配體與結(jié)合劑相互結(jié)合的程度，是反映結(jié)合劑質(zhì)量的主要指標(biāo)?？捎糜H和力常數(shù)表示。滴度(titer)：在沒有待測物的條件下，結(jié)合50%的標(biāo)記配體時的結(jié)合劑稀釋度。分離技術(shù)免疫分離法：利用抗原抗體結(jié)合形成的復(fù)合物化學(xué)分離法：PEG等物理分離法：電泳、層析、離子交換、活性炭或樹脂吸附等生物分離法：葡萄球菌A蛋白（SPA）固相分離法：包被試管、塑料球、磁化分離技術(shù)等。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方式標(biāo)準(zhǔn)曲線是衡量待測樣品中配體濃度的客觀尺度，也是反映檢測質(zhì)量的指標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)曲線要最大限度地反映量、效關(guān)系，便于自動化分析，使用靈活。每一批分析必須做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。常用的方法有l(wèi)og-logit坐標(biāo)系及線性回歸法：是目前公認(rèn)比較好的擬合方法，它是以結(jié)合率的logit值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，制成散點圖，然后用最小二乘法對各散點進行直線回歸，得出回歸方程，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，可用計算機或計算器完成。Log-Logist作圖法logitY=a+blogitY=ln(logX/1-B/Bo)

a＝截距b斜率為"-"值