紫杉醇的提取及分離純化

紫杉醇的提取及分離純化制作人：曲曉林符烊寧解說(shuō)員：曲曉林紫杉醇的結(jié)構(gòu)（圖）紫杉醇的藥用機(jī)理紫杉醇的生產(chǎn)生產(chǎn)技術(shù)的改良目前存在的問(wèn)題摘要●中文名：泰素、安素泰、紫素、特素●英文名：Taxol略寫：PTX分子式：C14H51NO14

藥用機(jī)理

紫杉醇獨(dú)特的抗癌活性機(jī)制在于它屬于有絲分裂抑制劑或紡錘體毒素，不但能抑制細(xì)胞的有絲分裂、紡錘體和紡錘絲的形成，從而阻止癌細(xì)胞的繁殖，而且能通過(guò)誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白的聚合和裝配，阻止微管發(fā)生解聚，使微管穩(wěn)定，因而對(duì)于許多耐常規(guī)化療藥物的腫瘤有活性，應(yīng)用前景十分廣闊。

最初的生產(chǎn)方式

紫杉醇的來(lái)源最初是以天然提取為主，主要是從由紅豆杉屬植物的樹皮中分離得到。紅豆杉是生長(zhǎng)極為緩慢的喬木或灌木，其樹皮中紫杉醇的含量平均為萬(wàn)分之一點(diǎn)五，從中提取紫杉醇的收率大約為萬(wàn)分之一，這樣支取1kg紫杉醇就需要樹皮10噸，這種生產(chǎn)紫杉醇的方法嚴(yán)重破壞資源和環(huán)境。為解決紫杉醇大量供應(yīng)的問(wèn)題，認(rèn)命蹭探索通過(guò)組織和細(xì)胞培養(yǎng)、化學(xué)合成等方法制取紫杉醇。紫杉醇的細(xì)胞工程化生產(chǎn)

利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物，首先要篩選含有目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的植物及最好的基因型，選擇合適的部位做外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中篩選合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)多代培養(yǎng)，得到穩(wěn)定生產(chǎn)的細(xì)胞系。從多個(gè)細(xì)胞系中篩選生長(zhǎng)和生產(chǎn)狀況最好的穩(wěn)定的細(xì)胞系，對(duì)之進(jìn)行生物合成途徑、誘導(dǎo)、固定化及基因修飾等方面的研究，最終在反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)大生產(chǎn)，進(jìn)行過(guò)程工程調(diào)控。

紫杉醇大概的生產(chǎn)流程外植體取紅豆杉當(dāng)年生健康莖葉消毒滅菌接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行組織培養(yǎng)從細(xì)胞中分離紫杉醇并提純關(guān)鍵步驟1外植體的選擇不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的能力和誘導(dǎo)的愈傷組織合成紫杉醇及紫杉烷的能力均不同。選擇外植體時(shí)應(yīng)考慮到外植體部位、取材季節(jié)、器官生理狀態(tài)和發(fā)育年齡以及外植體的大小等。多次的實(shí)驗(yàn)表明幼莖是誘導(dǎo)愈傷組織最適合的外植體。2.高產(chǎn)菌株的篩選解決植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物產(chǎn)量低的有效的手段之一是篩選高產(chǎn)細(xì)胞株系。高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選有很多不同的方法，如選擇含量高的外植體，單細(xì)胞克隆法，原生質(zhì)體培養(yǎng)法、小細(xì)胞團(tuán)法、抗性篩選法及負(fù)篩選法等。3.高產(chǎn)細(xì)胞系的建立及種質(zhì)保存將適量愈傷組織團(tuán)轉(zhuǎn)移到裝有50ml液體培養(yǎng)基的150ml三角瓶中，置旋轉(zhuǎn)式搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速160r*min-1離心5min，收集單細(xì)胞及小細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，即可以得到懸浮培養(yǎng)的無(wú)性細(xì)胞系。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生長(zhǎng)旺盛的紅豆杉基本上不啟動(dòng)次生代謝，只有當(dāng)細(xì)胞群體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，細(xì)胞的增殖基本停止，細(xì)胞有一定程度的分化后才開始合成和累積紫杉醇。針對(duì)紅豆杉細(xì)胞生長(zhǎng)和紫杉醇合成的特點(diǎn)，必須設(shè)計(jì)有針對(duì)性“兩步培養(yǎng)法”以獲得最佳產(chǎn)量。即第一步采用利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，以在最短的時(shí)間內(nèi)得到最大的生物量，然后更換成有利于目標(biāo)產(chǎn)物合成的生產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行第二步培養(yǎng)，以得到最高的紫杉醇產(chǎn)量。4.培養(yǎng)基的選擇Abou-Man為基本培養(yǎng)基H為基本生產(chǎn)培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化。ph5。4最適宜范圍4.5~6.220ml/L的水楊酸，100uml/L的茉莉酸甲酯和10mg/L的F5真菌誘導(dǎo)子對(duì)紫杉醇合成促進(jìn)效果相對(duì)較好。但總的來(lái)說(shuō)，單因子對(duì)紫杉醇合成的促進(jìn)作用都不明顯，最高含量也僅為干重的0.7/萬(wàn)左右。1固定化細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞有細(xì)胞壁和大的液泡，對(duì)剪切力十分敏感，易受機(jī)械損傷。固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是在可控條件下使植物懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞聚集成團(tuán)并且限制在特定空間和表面上，使這些細(xì)胞團(tuán)在不損失生物量的同時(shí)能連續(xù)不斷地分泌次生代謝物質(zhì)。固定化的方法主要有吸附在載體上，包埋在多孔凝膠珠或微膠囊中。目前這一技術(shù)應(yīng)用中遇到的難題是次生代謝產(chǎn)物釋放的問(wèn)題，因?yàn)榇蟛糠执紊x產(chǎn)物都儲(chǔ)存在液泡內(nèi)，對(duì)其自身的積累起著負(fù)反饋?zhàn)饔茫构潭ɑ囵B(yǎng)不能連續(xù)操作。另外，長(zhǎng)時(shí)間的固定化培養(yǎng)也易使細(xì)胞受污染。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)2.兩段培養(yǎng)法生長(zhǎng)與生產(chǎn)非偶聯(lián)型的培養(yǎng)體系，細(xì)胞的最適生長(zhǎng)條件和最適生產(chǎn)條件是不同的。兩段培養(yǎng)法就是根據(jù)這點(diǎn)，把培養(yǎng)過(guò)程分為細(xì)胞生長(zhǎng)期和次生代謝物生產(chǎn)期2個(gè)階段。在不同階段分別采取不同的培養(yǎng)條件，在細(xì)胞生長(zhǎng)期使接種細(xì)胞大量繁殖，提高比生長(zhǎng)速率，盡快獲得高密度細(xì)胞；在生產(chǎn)期則可保持細(xì)胞的高密度，維持存活率，降低細(xì)胞死亡速率，持續(xù)獲得目標(biāo)產(chǎn)物。

3.兩相培養(yǎng)法兩相培養(yǎng)法植物細(xì)胞兩相培養(yǎng)是在細(xì)胞外創(chuàng)造一個(gè)儲(chǔ)藏次生代謝產(chǎn)物的單元（如固體吸附劑），從而打破原有產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)、外水相的平衡，使目的產(chǎn)物產(chǎn)量大幅度提高。采用兩相培養(yǎng)技術(shù)可以減少次生代謝產(chǎn)物的反饋抑制作用，保護(hù)次生代謝產(chǎn)物免受酶的分解，簡(jiǎn)化下游處理過(guò)程，除去培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)。4前體飼喂

前體指處于目標(biāo)代謝物代謝途徑中上游的物質(zhì)，加入前體可以消除關(guān)鍵酶的阻礙或阻斷內(nèi)源性中間體的分隔和有效貯存，利于次生代謝物的生產(chǎn)。草酸鈉是紫醇C-10位乙酰基的前體物，加入后雖然可提高紫杉醇產(chǎn)量，但幅度有限；檸檬酸是紫杉醇三環(huán)二萜合成的前體物，加入后對(duì)紫杉醇合成的影響相對(duì)明顯；α-苯丙氨酸和β-苯丙氨酸均是紫杉醇C-13側(cè)鏈的前體物，若添加濃度合適，會(huì)對(duì)紫杉醇合成產(chǎn)生較大影響。研究發(fā)現(xiàn)，單種前體的加入對(duì)紫杉醇產(chǎn)量的影響不大，不同前體配伍可明顯提高紫杉醇產(chǎn)量。紫杉醇及紫杉烷細(xì)胞工程生產(chǎn)存在的問(wèn)題（1）許多建立起來(lái)的紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系不生產(chǎn)紫杉醇，只生產(chǎn)另一代謝支路的14位氧化的紫杉烷。（2）提高紫杉醇及紫杉烷產(chǎn)量的調(diào)控