海城市寵物犬沙門氏菌攜帶情況調(diào)查與耐藥性分析

沙門氏菌是桿狀的革蘭氏陰性兼性厭氧菌，屬于腸桿菌科，是一種非常重要的人畜共患疾病。目前，國內(nèi)外已有大量關(guān)于人源、雞源、豬源、食源、沙門氏菌耐藥性的研究，寵物犬源沙門氏菌耐藥情況國內(nèi)鮮有報(bào)道。目前，我國寵物數(shù)量不斷增加，人與寵物之間的依賴關(guān)系也日益凸顯。寵物行業(yè)的快速發(fā)展，愈來愈多的獸用甚至是人用抗生素被用于寵物疾病的預(yù)防和治療。然而，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，沙門氏菌的耐藥性也愈來愈嚴(yán)重，這不僅影響臨床治療效果，而且由于人與寵物的密切接觸，增加了耐藥細(xì)菌傳給人類的風(fēng)險(xiǎn)。本研究采用PCR技術(shù)對海城市寵物犬肛門棉拭子進(jìn)行分離鑒定，并確定分離株的血清型；Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法(K-B)測定寵物犬源沙門氏菌分離株對臨床常用藥物的敏感性，并測定blaOXA、sul2、gyrA、gyrB、floR、tetA和tetC基因，了解錦州地區(qū)寵物犬?dāng)y帶沙門氏菌的情況，并從基因水平結(jié)合表現(xiàn)耐藥進(jìn)行藥物敏感性分析，為錦州地區(qū)寵物犬臨床用藥提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株來源犬源沙門氏菌，采自遼寧省海城市寵物門診寵物犬肛門棉拭子。1.1.2主要培養(yǎng)基和試劑緩沖蛋白胨水（BPW）、普通瓊脂培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。藥敏紙片購于上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.2方法1.2.1樣本的采集2018年5～12月，于海城市6家寵物醫(yī)院隨機(jī)共采集健康犬82份和患病犬209份，總291份犬肛棉拭子樣品。1.2.2細(xì)菌分離、鑒定無菌操作把肛門棉拭子放入到5LBPW增菌液中37℃，培養(yǎng)18h。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過的樣品混合物使其均勻，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi)，于42℃±1℃培養(yǎng)18～24h。取過夜培養(yǎng)的菌液，按照DNA提取試劑盒說明提取細(xì)菌組總DNA作為模版。參照文獻(xiàn)[1]合成沙門氏菌引物，invA（5’→3’）：F:GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA，R:TCATCGCACCGTCAAAGGAACC，片段長度為285pb。PCR反應(yīng)體系為25μL：BufferMix12.5μL，dNTPs5μL，上下游引物各1μL，ddH2O調(diào)整總體積25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察。1.2.3血清型鑒定依文獻(xiàn)合成我國報(bào)道的主要沙門氏菌血清型（O抗原中B、C1、D和E1及鞭毛H抗原H1相和H2相）引物，O抗原（5’-3’）：B群：F:GCGATTAGAGCATGTATATGGR:CAGTTCCAACTTGATACTCAGT，片段大小為216pb；C1群：F：GACATGACTTTGAAATCGGGTA；R:ATTCCTACACGCACTAATACTG，片段大小為760pb；D群：F:GGTAAACTTATCGTCTCCATCA；R:CTTAGCAAGGAAGAGGAACAAT，片段長度為385pb;E群:F:CTTTGCTGAGCTAGGTATAAGTA，R:GCTATTCAAAGACGCTGTATATC，片段長度為1323pb。H抗原(5’-3’)：H1相：F:TGACCCAGAATAACCTGAAC，R:TAACGCAGTAAAGAGAGGAC，片段長度為1450pb；H2相：F:ATGGCACAAGTAATCAACAC，R:TAGTCGGAATCTTCGATACG，片段大小1409pb。PCR反應(yīng)體系為25μL，各組分如下BufferMix12.5μL，dNTPs5μL，上下游引物各1μL，ddH2O5.5μL。PCR反應(yīng)條件：擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。1.2.4藥敏試驗(yàn)采用K-B瓊脂法檢測分離菌對常用16種抗菌藥物進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。1.2.5耐藥基因檢測參照文獻(xiàn)合成檢測沙門氏菌5大類抗生素7種耐藥基因PCR引物序列（5’-3’）。B-內(nèi)酰胺類（blaOXA）：F：ACACAATACCATATCCAACTTCGC，R:AGTGTGTTTAGAATGGTGATC，產(chǎn)物大小876bp。四環(huán)素類（TetA）：F:TACGGGAGTTTGTTGGA，R:GTATGGAGGATGTGGTTTC，產(chǎn)物大小525bp；tetC：F:ACTTGGAGCCACTATCGAC，R:CTACAATCCATGCCAACCC，產(chǎn)物大小427bp?？Z酮類（GyrA）：F:TGCCAGATGTCCGAGAT，R:GTATAACGCATTGCCGC，2產(chǎn)物大小69bp；gyrB：F:CGCCTCCCAGACCAAAGACA，R:TCACGACCGATACCACAGCC，產(chǎn)物大小448bp?；前奉悾╯ul2）：F:CGGCATCGTCAACATAACC，R:GTGTGCGATGAAGTCAG，產(chǎn)物大小722bp。氯霉素類（floR）：F:TATCTCCCTGTCGTTCCAG，R:AGAACTCCGCCGATCAATG，產(chǎn)物大小399bp。PCR反應(yīng)體系為25μL:BufferMix12.5μL，dNTPs1μL，上下游引物各1μL，ddH2O9.5μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。2結(jié)果2.1沙門氏菌分離株的PCR鑒定及菌株背景通過PCR檢測出9個(gè)樣本在285pb左右出現(xiàn)明亮的條帶，與預(yù)計(jì)目的條帶相符，說明成功的分離到9株沙門氏菌，海城市寵物犬沙門氏菌的攜帶率為3.09%，PCR電泳圖（見圖1）；9株沙門氏菌中有7株來源于1歲以內(nèi)的犬，占77.8%，且集中在10～11月份，說明寵物犬?dāng)y帶沙門氏菌與年齡和季節(jié)有一定的相關(guān)性，9株沙門氏菌背景見表1。圖19株沙門氏菌PCR電泳擴(kuò)增圖2.2沙門氏菌血清型鑒定PCR檢測顯示9株沙門氏菌種有7株在216pb左右出現(xiàn)條帶，有2株在385pb左右出現(xiàn)條帶，對其針對H抗原進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，對其PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，并通過基因blast比對，確定7株沙門氏菌為鼠傷寒沙門氏菌，2株為腸炎沙門氏菌。2.3表觀耐藥性檢測藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示9株對氨基糖苷類（GEN、STR、TOB、AMK、NEO）、大環(huán)內(nèi)脂類（ERY、MID）、磺胺類（SXT）、氯霉素類（CHL）、β-內(nèi)酰胺類（AML、PEN）、喹諾酮類（NOR、CIP）耐藥率100%，四環(huán)素類（DOC）耐藥率89%，喹諾酮類（LEV）耐藥率11%，β-內(nèi)酰胺類（CTX）敏感率100%。2.4耐藥基因檢測結(jié)果在9株沙門氏菌分離株的7種耐藥基因檢測中，共檢出5種常見耐藥基因，分別是β-內(nèi)酰胺類blaOXA基因，磺胺類sul2基因，氯霉素floR基因，奎諾酮類gyra和gyrb基因。檢出率為71.4%（5/7）每株菌對5種耐藥基因檢出率100%。沒有檢測到四環(huán)素類耐藥基因。3討論已有許多寵物犬?dāng)y帶沙門氏菌報(bào)道，王元蘭等對合肥市寵物犬采集的746份樣本中沙門氏菌進(jìn)行了調(diào)查，分離率為2.55%，主要以腸炎沙門氏菌為主，其次是德爾卑沙門氏菌。LeahyAM等對在2013年5月至2014年12月間對7個(gè)德克薩斯州動(dòng)物收容所554只犬糞便樣本進(jìn)行沙門氏菌的分離鑒定，檢測出27個(gè)陽性樣本，其攜帶率為4.90%；且與腹瀉存在相關(guān)性（p=0.09），沙門氏菌的流行率與年齡、性別沒有顯著差異，常見的血清型是Newport沙門氏菌(22%)和Javiana沙門氏菌(15%)。WillenJ.Botha等對74只自然感染細(xì)小病毒寵物犬和42只健康犬的糞便樣本進(jìn)行沙門菌的分離、藥敏試驗(yàn)和血清分型，共分離到32株沙門氏菌，感染犬和健康犬的糞便沙門氏菌的攜帶率分別為22%和31%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；且與年齡、體重住院時(shí)間之間無顯著的相關(guān)性，只有9株沙門氏菌鑒定出4個(gè)血清型，其中4株Heidelberg沙門氏菌、2株Cotia沙門氏菌、2株Chile沙門氏菌、1株Braenderup沙門氏菌。本研究表明在海城市寵物犬291份樣本中，沙門氏菌檢出率為3.09%（9/291），發(fā)病樣本的攜帶率為3.35%，健康樣本攜帶率為2.44%；12月齡以內(nèi)陽性犬占78%，12月齡以上的陽性犬占22%，雄性占66.7%，雌性占33.3%；陽性犬檢出沙門氏菌的時(shí)間集中分布在9～11月份。說明錦州寵物犬源沙門氏菌攜帶情況可能與寵物犬年齡和感染季節(jié)有一定的相關(guān)性，與性別及健康狀況無關(guān)，這一結(jié)果也與WillenJ.Botha報(bào)道基本一致，但血清型上述文獻(xiàn)報(bào)道有一定的差異性。說明寵物犬沙門氏感染不同地區(qū)分離到的血清型存在一定區(qū)域性。寵物犬沙門氏感染年齡在12個(gè)月齡以內(nèi)幼齡犬的原因可能是與缺乏成熟的腸道微生物群有關(guān)；同時(shí)，幼齡犬免疫系統(tǒng)不夠完善，免疫力低下所致，而隨著年齡的增長，免疫力提高及寵物主人提供良好的環(huán)境和管理?xiàng)l件，致使發(fā)病率下降。近年來，由于寵物抗生素的不合理使用，導(dǎo)致沙門氏菌耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，已成為危害人類健康的一大難題。軒慧勇等從新疆烏魯木齊市77份寵物糞便中分離到沙門氏菌36株，除了頭孢噻呋、安普霉素、阿米卡星、硫酸慶大霉素和多黏菌素外，寵物犬源沙門氏菌對其他被檢抗菌藥藥物的耐藥性高達(dá)97.0%以上，tetB、blaTEM、blaOXA，qurS、oqxA、oqxB、aac(6’)-Ib-cr、ant(3’)-Ia和floR的基因檢出率在97.0%以上，而aadA2基因的檢出率也在72.0%以上。VictorA等在2016年8～10月西印度群島格林納達(dá)144只非腹瀉犬的糞便樣本中分離到35株沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)顯示，對環(huán)丙沙星和頭孢噻呋等人類沙門氏菌病患者目前使用的藥物沒有耐藥性。一個(gè)分離株（2.9%）對新霉素有耐藥性，兩個(gè)分離株（5.7%）對新霉素有中度敏感性，另一個(gè)分離株（2.9%）對四環(huán)素有中度敏感性。Tadesse等對埃塞俄比亞中部地區(qū)人和動(dòng)物沙門氏菌β-內(nèi)酰胺類和奎諾酮類抗生素耐藥基因檢測是發(fā)現(xiàn)blaOXA檢出率79.1%，sul2檢出率30.3%。本研究在對9株沙門氏菌分離株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有菌株對頭孢噻呋均敏感，而對復(fù)方新諾明、青霉素、慶大霉素、妥布霉素、亞胺培南和氯霉素耐藥性最強(qiáng)。這可能與臨床用藥和檢測地區(qū)有關(guān)，同時(shí)，不同國家、地區(qū)在寵物犬治療或藥物預(yù)防過程中使用藥物的差異、劑量及不合理應(yīng)用的因素也不同。對9株