經(jīng)驗證的穩(wěn)定RSV-pre-F三聚體蛋白-助力疫苗領(lǐng)域百億藍(lán)海市場角逐戰(zhàn)

經(jīng)驗證的穩(wěn)定RSV-pre-F三聚體蛋白--助力疫苗領(lǐng)域百億藍(lán)海市場角逐戰(zhàn)前言歷經(jīng)六十年，RSV疫苗終于上市。今年上半年，美國FDA先后批準(zhǔn)GSK和輝瑞的RSV疫苗上市，主要用于60歲以上老年人，且輝瑞的疫苗擴(kuò)展到妊娠32-36周的孕婦。至此RSV疫苗的百億藍(lán)海市場角逐戰(zhàn)正式打響。01RSV概述RSV（呼吸道合胞病毒）是一種常見的呼吸道RNA病毒，針對年幼的兒童及60歲以上的老人會導(dǎo)致嚴(yán)重的下呼吸道感染。它包含10個基因，編碼11種蛋白質(zhì)，其中G蛋白和F蛋白是病毒的兩個主要保護(hù)性抗原。G蛋白具有較高的遺傳多樣性，用以區(qū)分RSV的亞型。F蛋白是一種I型病毒融合蛋白，具有高度保守性，更適合作為疫苗的靶蛋白。（詳見：呼吸道合胞體病毒（RSV）抗原及抗體試劑）02RSV疫苗研究RSV疫苗的開發(fā)真可謂是一路“披荊斬棘”，類型包括減毒疫苗、亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗等，除了已上市的幾款疫苗，大多處于臨床或臨床前階段。且上市的疫苗主要用于60歲以上的老人，適用于嬰兒和兒童的疫苗還在研發(fā)中。早期的滅活RSV疫苗在臨床中出現(xiàn)過接種后呼吸道癥狀（ERD）增強(qiáng)，這可能與疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的弱中和活性的抗體有關(guān)。隨著科學(xué)家的不斷探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)適合疫苗開發(fā)的F蛋白具有兩種構(gòu)象，即融合前F蛋白（pre-F）和融合后F蛋白（post-F），且pre-F構(gòu)象可誘導(dǎo)更有效的中和抗體，這可能是解決滅活疫苗產(chǎn)生ERD反應(yīng)的關(guān)鍵。因此基于pre-F蛋白構(gòu)象的研究成為RSV疫苗開發(fā)的重要方向，獲得上市批準(zhǔn)的RSV疫苗均為基于pre-F的重組蛋白亞單位疫苗。03RSVpre-F蛋白RSV病毒表面的F蛋白通常以三聚體形式存在，與硫酸乙酰肝素結(jié)合，促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞的融合。F蛋白在不同毒株中相對保守，且在病毒入侵過程中起到關(guān)鍵作用，是RSV疫苗開發(fā)的重要靶點(diǎn)。在病毒與宿主細(xì)胞膜融合的過程中，F(xiàn)蛋白構(gòu)象會發(fā)生變化，從融合前pre-F構(gòu)象轉(zhuǎn)化為融合后post-F構(gòu)象。研究發(fā)現(xiàn)RSV-F存在6種不同的抗原位點(diǎn)，其中4種抗原位點(diǎn)在融合前后均存在。而Φ和Ⅴ位點(diǎn)是僅存在于pre-F構(gòu)象中的中和抗體敏感位點(diǎn)，因此pre-F蛋白能誘導(dǎo)更高的中和抗體反應(yīng)，是疫苗設(shè)計的關(guān)鍵。因為pre-F蛋白處于亞穩(wěn)定狀態(tài)，容易轉(zhuǎn)變?yōu)閜ost-F蛋白，所以，如何構(gòu)建穩(wěn)定的pre-F蛋白是疫苗開發(fā)的關(guān)鍵。融合前后RSVF蛋白的構(gòu)象變化（源自參考文獻(xiàn)：doi:10.1007/978-3-642-38919-1_4.）?義翹神州RSV特色產(chǎn)品義翹神州已開發(fā)具有穩(wěn)定融合前構(gòu)象的Pre-F蛋白（貨號：11049-VNAS）、RSVPre-F小鼠血抗體滴度檢測試劑盒（貨號：KIT053）、RSV-F(A2)肽庫（貨號：PP004）等產(chǎn)品以助力RSV疫苗開發(fā)。RSVPre-F重組蛋白，Cat:11049-VNAS經(jīng)抗體驗證：具有穩(wěn)定的融合前構(gòu)象經(jīng)SEC-MALS驗證：三聚體比例≥90%高批間一致性CHO穩(wěn)定株表達(dá)，單批次g級供應(yīng)高純度，三聚體比例≥90%Purity:≥95%bySDS,≥90%bySEC-MALS(MW~170kDa)高批間一致性ELISAassayvalidated:ImmobilizedRSVPre-fusionproteincanbindtoasite?specificPre-Fantibody高穩(wěn)定性RSVPre-F蛋白(Cat:11049-VNAS)經(jīng)反復(fù)凍融5次或置于4℃放置48h后，理化性質(zhì)不發(fā)生改變，穩(wěn)定性高。檢測樣品SDS濃度HPLC純度分子量（MALS）原液99%98%170kDa凍融5次99%98%172kDa4℃放置48h98%98%171kDaELISA結(jié)合實驗驗證，經(jīng)過5次反復(fù)凍融后的Pre-F蛋白與抗體的結(jié)合活性沒有降低。不同構(gòu)象蛋白識別特異性抗體驗證不同構(gòu)象蛋白特異識別融合前構(gòu)象Φ位點(diǎn)抗體特異識別融合前構(gòu)象Ⅴ位點(diǎn)抗體特異識別融合前構(gòu)象Quaternary-Dependent抗體特異識別Ⅱ位點(diǎn)抗體Pre-F蛋白（Cat：11049-VNAS）√√√√疫苗開發(fā)中的Pre-F蛋白√√√√Post-F蛋白√·Pre-F特異性抗體（識別位點(diǎn)?）驗證數(shù)據(jù)ImmobilizedPre-Fproteinbindstopre-FspecificantibodythattargetsantigenicSite?ataconcentrationof0.02μg/mL(100μL/well).Post-F(HisTag)isnotrecognizedbythementionedantibodyatlowconcentrations(routinelytested).·Pre-F特異性抗體（識別位點(diǎn)Ⅴ）驗證數(shù)據(jù)ImmobilizedPre-Fproteinbindstoapre-FspecificantibodytargetingantigenicSiteVataconcentrationof0.05μg/mL(100μL/well).Post-F(HisTag)isnotrecognizedbythementionedantibodyatlowconcentrations(routinelytested).·Pre-F特異性抗體（識別Quaternary-Dependent）驗證數(shù)據(jù)ImmobilizedPre-Fproteinbindstoapre-Fspecificantibodythattargetsaquaternary-dependentepitopeataconcentrationof0.2μg/mL(100μL/well).Post-F(HisTag)isnotrecognizedbythementionedantibodyatlowconcentrations(routinelytested).·融合前后構(gòu)象均識別抗體（識別位點(diǎn)II）驗證數(shù)據(jù)ImmobilizedPre-Fprotein,alongwithPost-FbindstoanRSV-specificantibodythattargetsantigenicSiteII(routinelytested)ataconcentrationof0.015μg/mL(100μL/well).【參考文獻(xiàn)】1.ThomasWilliams,etal.ResultsfromthesecondWHOexternalqualityassessmentforthemoleculardetectionofrespiratorysyncytialvirus,2019-2020.2.Drysdal,etal.Prioritiesfordevelopingrespiratorysyncytialvirusvaccinesindifferenttargetpopulations.Sci.Transl.Med.20203.Smith,etal.DevelopmentofanintradermalDNAvaccinedeliverystrategytoachievesingle-doseimmunityagainstrespiratorysyncytialvirus.Vaccine.20174.LanZhang,etal.DesignandcharacterizationofafusionglycoproteinvaccineforRespiratorySyncytialViruswithimprovedstability.Vaccine.20185.Jacque,etal.Hyper-EnrichedAnti-RSVImmunoglobulinsNasallyAdministered:APromisingApproachforRespiratorySyncytialVirusProphylaxis.FrontiersinImmunology.20216.Lee,etal.Baculovirus-expressedvirus-likeparticlevaccineincombinationwithDNAencodingthefusionproteinconfersprotectionagainstrespiratorysyncytialvirus.Vaccine.20147.Griffiths,etal.RespiratorySyncytialVirus:Infection,Detection,andNewOptionsforPreventionandTreatment.ClinicalMicrobiologyReviews,20178.McLellanJS,ChenM,LeungS,etal.StructureofRSVfusionglycoproteintrimerboundtoaprefusion-specificneutralizingantibody.Science.2013;340(6136):1113-1117.9.GilmanMSA,MoinSM,MasV,ChenM,PatelNK,etal.CharacterizationofaPrefusion-SpecificAntibodyThatRecognizesaQuaternary,Cleavage-DependentEpitopeontheRSVFusionGlycopro