THBIQA 0003.4-2024 食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法 第4部分：秋刀魚實時熒光PCR法

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T/HBIQAT/HBIQA0003.4—2024食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法4PCRDetectionofcommonHistamine-richfishderivedingredientinfoodPart4:CololabissairaReal-timePCRmethod2024-08-15發(fā)布 2024-10-15實施河北省檢驗檢疫學會發(fā)布T/HBIQA0003.4—2024T/HBIQA0003.4—2024前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。T/HBIQA0003-2024《食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法實時熒光PCR法系列標準》分為7個部分：1PCR2PCR3PCR4PCR5PCR6PCR法第7部分：藍點馬鮫實時熒光PCR法T/HBIQA0003.4-20244T/HBIQA0003.4—2024T/HBIQA0003.4—2024PAGEPAGE2食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法第4部分：秋刀魚實時熒光PCR法范圍本部分規(guī)定了食品中秋刀魚源性成分的實時熒光PCR檢測方法。本部分適用于食品中秋刀魚源性成分的定性檢測。本部分所規(guī)定方法的最低檢出限（LOD）為0.1%（質量分數(shù)）。（）GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測術語和定義下列術語和定義適用于本標準。Cololabissaira。實時熒光PCR real-time在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)控整個PCR擴增過程。Ct值 cyclethresholdvalue每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)?？s略語下列縮略語適用于本文件。PCR（Polymerasechainreaction）DNA（deoxyribonuleicacid）Cytbb基因（Cytochromebgene）dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）CTAB（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羥甲基（tris（hydroxymethyl）aminomethane）EDTA（ethylenediaminetetraaceticacid）FAM（carboxyfluorescein）BHQ11原理實時熒光法是在提取樣品DNA為模板，以秋刀魚Cytb基因中相對保守且高度特異的引物和探針進行目標物的實時熒光試劑和材料GB/T6682。表1引物和探針序列名稱序列（5′-3′）目的基因內參照F:TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA真核生物18SrRNA基因R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTP:FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-BHQ1秋刀魚F:TATTGCAACAGCCTTCTCATCAGCytb基因R:TTGCATGCATATTTCGGATAAGTCP:FAM-CGCCCATATCTGCCGAGACGTGA-BHQ1CTAB裂解液：20g/LCTAB，0.1mol/LTris-HCI（pH8.0），1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA（pH8.0）。CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl。蛋白酶K（20mg/mL），-2075%熒光預混液（2×）。TE緩沖（Tris-ClEDTA沖液mmol/LTris-HCl mmol/LEDTA(pH8.0)。儀器和設備儀。12000g。7.5 （0.1μL～2.5μL,1μL～10μL,10μL～100μL,20μL～200μL,100μL～1000μL）。pH0.1。0.01g。均質器。檢驗步驟樣品前處理魚罐頭、魚腸、魚丸等食品取肉糜300mg，置于三氯甲烷:甲醇:水混合溶液(1:2:0.8)中室溫孵育過夜，去除油脂的肌肉組織可用于核酸提取；300DNA50mg21.5mL10μLK，min12000r/min5min400μL:12000r/min5，吸取上清液至另一新離心管中，加入0.8倍體積異丙醇，混勻后室溫下靜置1h12000r/min1050μLDNA-20℃保存DNADNA。DNA取適量DNA溶液原液，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別測定260nm和280nm處的吸光值A260和A280。DNA的濃度按照公式（1）計算：c=A260×N×50 （1）公式（1）中：c ——DNA（μg/μL）；A260——260nm處的吸光值；N ——當A260/A280比值在1.7～2.0之間時，適宜于實時熒光PCR擴增。實時熒光檢測實時熒光反應體系實時熒光PCR反應參數(shù)見表2。每個樣品各做兩個平行管，可先將反應試劑及引物預混成混合液。表2實時熒光PCR反應體系試劑名稱終濃度反應體系/μLPremixExTaqTM（2×）1×12.5F(10μmol/L)400nmol/L1R(10μmol/L)400nmol/L1P(10μmol/L)400nmol/L1DNA模板(50-100ng/μL)—2.0補水至—25擴增條件℃預變性30℃15℃35s（），40試驗對照檢驗過程中分別設陽性對照、陰性對照和空白對照。以秋刀魚提取的DNA為陽性對照，以已知不含有秋刀魚的樣品提取的DNA為陰性對照，以滅菌水為空白對照。樣品、陽性對照、陰性對照、空白對照各設置兩個平行。質量控制以下條件有一條不滿足時，實驗視為無效：Ct>40.0。Ct>40.0。Ct值<30.0。Ct值＜30.0。結果判定在符合第9章的情況下，被檢樣品進行檢測時：Ct值≤35.0A；Ct值≥40.035.0＜Ct值＜40.0Ct值仍為＜40.0，且出現(xiàn)典型擴增曲線，Ct值≥40.0結果表述防污染措施檢測過程中防止交叉污染的措施按照G