酵母各種雜交

酵母雜交(zájiāo)技術(shù)2016-7共三十八頁相關(guān)知識(shí)：

1、順式作用元件：存在于基因旁側(cè)序列中能影響基因表達(dá)的序列。包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等，作用是參與(cānyù)基因表達(dá)的調(diào)控。2、反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子）：能直接或間接地識(shí)別或結(jié)合在各類順式作用元件核心序列上，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)。3、報(bào)告基因：是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因。共三十八頁4、cDNA文庫：以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆擴(kuò)增。這些在重組體內(nèi)(tǐnèi)的cDNA的集合即cDNA文庫。共三十八頁基本原理真核生長轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)上可以分開(fēnkāi)的、功能上也相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的結(jié)構(gòu)域：轉(zhuǎn)錄(zhuǎnlù)激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activationdomain)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNAbindingdomain)轉(zhuǎn)錄激活因子

BD：識(shí)別DNA上特定序列，轉(zhuǎn)錄激活域定位調(diào)控基因的上游。

AD：與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體其他成分作用，從而啟動(dòng)所調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。共三十八頁

兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分開時(shí)仍具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有他們以適當(dāng)途徑在空間上相互靠近時(shí)，才能具有轉(zhuǎn)錄因子活性，激活報(bào)告基因的表達(dá)。

酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因(jīyīn)通過激活報(bào)告基因(jīyīn)的表達(dá)，探測蛋白-蛋白的相互作用。酵母雙雜交原理示意圖 X DBD Reportergene Prey Bait AD Y Expression UAS 共三十八頁共三十八頁DNA結(jié)合域（DNA-BD）：N端1-147氨基酸,可識(shí)別(shíbié)并結(jié)合酵母半乳糖苷酶的上游激活序列(UAS)。轉(zhuǎn)錄激活域（AD）：C端786-881氨基酸,通過同轉(zhuǎn)錄機(jī)制的其它成分之間的結(jié)合以啟動(dòng)上游激活序列（UAS）下游的基因轉(zhuǎn)錄。酵母轉(zhuǎn)錄(zhuǎnlù)因子GAL4結(jié)構(gòu)特點(diǎn)共三十八頁共三十八頁酵母(jiàomǔ)雙雜交步驟1、構(gòu)建質(zhì)粒（誘餌蛋白不發(fā)生自激活）2、轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（本身不表達(dá)GAL4）3、陽性(yángxìng)篩選共三十八頁1.（1）BD-plasmid

靶基因(蛋白(dànbái)A基因)按正確的讀碼結(jié)構(gòu)和取向克隆在GAL4的BD之后。篩選標(biāo)志：TRP（2）AD-plasmid

蛋白(dànbái)B基因按正確閱讀框克隆到GAL4的AD片斷之后。篩選標(biāo)志：LEU2

共三十八頁（1）雙載體轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)能合成亮氨酸和色氨酸。Trp-Leu-2.兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母菌（HF7c）3.篩選(shāixuǎn)觀察（2）篩選蛋白A和蛋白B能相互作用的雙載體轉(zhuǎn)化子。Trp-Leu-His-共三十八頁酵母(jiàomǔ)細(xì)胞cDNA文庫(wénkù)

誘鉺蛋白基因多克隆位點(diǎn)DNA-BD載體AD載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞篩選平板生長菌苔篩選平板生長菌苔同一個(gè)三重篩選平板克?。ㄕT餌與靶蛋白相互作用）鑒定β-半乳糖苷酶共三十八頁酵母雙雜交系統(tǒng)(xìtǒng)的應(yīng)用：（1）發(fā)現(xiàn)新蛋白和蛋白的新功能（2）研究(yánjiū)抗原和抗體的作用（細(xì)胞內(nèi)）（3）檢測已知蛋白質(zhì)之間的相互作用（4）確定未知蛋白之間的相互作用（5）確定基因治療中多肽類藥物的作用機(jī)理共三十八頁應(yīng)用(yìngyòng)舉例《應(yīng)用(yìngyòng)酵母雙雜交篩選與FAM172A相互作用蛋白的研究》實(shí)驗(yàn)步驟：（1）誘餌質(zhì)粒構(gòu)建：①擴(kuò)增誘餌蛋白基因②與質(zhì)粒載體連接③重組載體鑒定④誘餌蛋白自我轉(zhuǎn)錄激活檢測：將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌株，若轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒的酵母菌落表達(dá)β-半乳糖苷酶，則可使底物X-Gal變藍(lán)，說明存在自激活（假陽性），否則無自激活。共三十八頁（2）人胎腦cDNA質(zhì)粒構(gòu)建(ɡòujiàn)共三十八頁（3）酵母雙雜交篩選人胎腦cDNA文庫①人胎腦cDNA文庫轉(zhuǎn)化誘餌酵母菌及初步篩選:菌液，分別涂布于培養(yǎng)基（A：Leu-/Trp-、B:Leu-/Trp-/His-），A平板上的克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋度計(jì)算轉(zhuǎn)庫效率（轉(zhuǎn)庫效率只有達(dá)到(dádào)

1X107-1X108cfu/gDNA以上才能進(jìn)行文庫的篩選，以保證不會(huì)丟失陽性克?、诎肴樘擒彰缚寺∞D(zhuǎn)移濾紙實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選:從B:Leu-/Trp-/His-平板上挑取35個(gè)單克隆進(jìn)行β-半乳糖苷酶克隆轉(zhuǎn)移濾紙實(shí)驗(yàn)，變藍(lán)色的為陽性克隆。共三十八頁（3）陽性雜交克隆的質(zhì)粒抽提及一對(duì)一驗(yàn)證:對(duì)上述篩選的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，再次進(jìn)行抗性篩選和質(zhì)粒抽提后，一對(duì)一與誘餌質(zhì)粒pGB-FAM172A共轉(zhuǎn)酵母(jiàomǔ)細(xì)胞Y190驗(yàn)證。（4）再次陽性者抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序及生物信息學(xué)分析:利用NCBI對(duì)測序所得到的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。共三十八頁結(jié)果(jiēguǒ)對(duì)10個(gè)陽性克隆相應(yīng)的質(zhì)粒進(jìn)行測序后，通過BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫中對(duì)應(yīng)(duìyìng)6個(gè)不同的基因，編碼6種已知的蛋白質(zhì)：RTCD1、MOCS2、A2M、KCNIP1、BTBD2和TOX2，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)獲得了它們的功能信息。其中A2M與糖尿病血管病變密切相關(guān)，也進(jìn)一步提示FAM172A參與了糖尿病大血管病變的發(fā)病。共三十八頁（1）用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來研究蛋白質(zhì)的相互作用，方法精確，不受外界影響，易于操作;（2）所有操作均在核酸水平進(jìn)行，無需(wúxū)純化大量的蛋白質(zhì)，可以精確測定蛋白質(zhì)的弱相互作用；（3）運(yùn)用范圍較大：酵母雙雜交系統(tǒng)中的誘餌蛋白可以是完整的蛋白質(zhì)，也可以是蛋白質(zhì)的一個(gè)功能區(qū)，可以大到一個(gè)完整的腫瘤抑制蛋白，也可以小到一個(gè)約22個(gè)氨基酸的多肽。酵母雙雜交系統(tǒng)(xìtǒng)的優(yōu)點(diǎn)

共三十八頁局限性1、它并非對(duì)所有蛋白質(zhì)都適用。

有其原理決定，融合蛋白的相互作用激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的，而表達(dá)的融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)能否正確折疊并運(yùn)至核內(nèi)是檢測的前提條件。2、假陽性較多：

某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì)。如AD融合靶蛋白有DNA的特異

結(jié)合，則可單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過其它的實(shí)驗(yàn)(shíyàn)手段來驗(yàn)證。共三十八頁局限性

3、陰性干擾：兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測不出來。

蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達(dá)或不能準(zhǔn)確定位到胞核內(nèi)。4、融合蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞(xìbāo)有毒性，應(yīng)選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。共三十八頁在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了酵母單雜交、酵母三雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間的研究、三種(sānzhǒnɡ)不同蛋白之間的互作研究。共三十八頁酵母(jiàomǔ)單雜交

酵母單雜交體系是借鑒酵母雙雜交體系的基本原理，通過觀察酵母細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因的表達(dá)(biǎodá)狀況，研究DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。共三十八頁共三十八頁酵母(jiàomǔ)單雜交步驟設(shè)計(jì)含目的基因（誘餌）和下游報(bào)告基因的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中。將文庫蛋白的編碼(biānmǎ)基因片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入同一酵母細(xì)胞中。若文庫蛋白與目的基因相互作用，可通過報(bào)告基因的表達(dá)將其篩選。共三十八頁共三十八頁單雜交(zájiāo)優(yōu)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)過程簡單，耗時(shí)短：能直接識(shí)別并找出與特異順式作用元件相結(jié)合的蛋白(dànbái)質(zhì)及其編碼序列，而不需通過制備純化蛋白(dànbái)或抗體等繁瑣的生化手段來建立這種相互作用關(guān)系；酵母屬于真核生物，且蛋白質(zhì)處于自然構(gòu)象，避免了體外研究的不足。共三十八頁單雜交(zájiāo)局限性與內(nèi)源性的表達(dá)激活因子發(fā)生相互作用；假陽性：插入的靶元件有可能不需要轉(zhuǎn)錄激活因子就可以直接激活報(bào)道基因的表達(dá)；假陰性：融合蛋白有毒性、不能穩(wěn)定(wěndìng)地表達(dá)，錯(cuò)誤折疊不能準(zhǔn)確定位于酵母細(xì)胞核內(nèi)、DNA結(jié)合位點(diǎn)被封閉；酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白修飾缺乏；共三十八頁TF:介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的第三種因子(yīnzǐ)，

可以是蛋白質(zhì),DNA,RNA或小分子配體。兩個(gè)蛋白之間通過第三者發(fā)生(fāshēng)相互作用，用來檢測蛋白質(zhì)與RNA、蛋白、小分子配體間相互作用酵母三雜交技術(shù)共三十八頁應(yīng)用(yìngyòng)1、研究(yánjiū)RNA-蛋白質(zhì)間相互作用共三十八頁應(yīng)用(yìngyòng)2、研究(yánjiū)小分子受體與蛋白質(zhì)受體間相互作用共三十八頁

在該系統(tǒng)(xìtǒng)中,第三個(gè)雜交小分子為Dex(地塞米松)-FK506偶聯(lián)體,利用已知的地賽米松受體和FK506受體FKBP12分別構(gòu)建AD和BD融合蛋白,三種分子相互作用后,成功的激活了報(bào)道基因的表達(dá);而當(dāng)單體FK506分子引入時(shí),由于競爭性結(jié)合FKBP12,導(dǎo)致三元復(fù)合物無法形成,幾乎完全抑制了報(bào)道基因的表達(dá)。舉例(jǔlì)共三十八頁3、研究(yánjiū)復(fù)雜的蛋白-蛋白間相互作用應(yīng)用(yìngyòng)共三十八頁不能用來研究位于細(xì)胞核外的RNA分子；許多蛋白質(zhì)需要輔因子作用使其結(jié)合到它們的對(duì)應(yīng)的RNA上，然而這些輔因子可能(kěnéng)定位于細(xì)胞的其他區(qū)域不能在核中發(fā)揮作用（假陰性）;不適用經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾才能與蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA分子三雜交(zájiāo)局限性共三十八頁細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行核酸水平操作(cāozuò)簡單三者優(yōu)點(diǎn)(yōudiǎn)共三十八頁假陽性假陰性對(duì)核外分子無用對(duì)需要進(jìn)行復(fù)雜(fùzá)轉(zhuǎn)錄后修飾的分子無用三者局限(júxiàn)共三十八頁謝