醫(yī)學(xué)培訓(xùn)課件 第12章 固相膜免疫測定

第十二第一節(jié)概述一、免疫測定分類二、免疫測定原理三、固相免疫測定四、固相膜的特點五、常用的固相膜六、固相膜的技術(shù)要求第十二章固相膜免疫測定第二節(jié)免疫金標(biāo)記技術(shù)一、膠體金的制備第三節(jié)膜載體免疫測定的種類與原理一、膜固相免疫測定的特點二、固相微孔膜測定種類三、免疫滲濾試驗和免疫層析試驗四、酶聯(lián)免疫斑點試驗五、免疫印跡六、放射免疫沉淀試驗思考題小結(jié)隨著免疫學(xué)技術(shù)和相關(guān)生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測方法上派生出了多種類型的固相膜免疫快速檢測試驗。該類試驗的最大特點是不需要大型設(shè)備，對檢測人員稍加培訓(xùn)即能掌握操作要求和判定標(biāo)準(zhǔn)。

第一節(jié)概述標(biāo)記免疫測定放射免疫測定1960’酶免疫測定1970’熒光免疫測定1980’－1990’化學(xué)發(fā)光免疫測定1990’－膜固相免疫測定1990’－一、免疫測定分類免疫濁度測定Ag+Ab

AgAb+Ab標(biāo)記免疫測定

Ag+Ab*AgAb*+Ab*

（B）（F）二、免疫測定原理利用抗原抗體反應(yīng)檢測標(biāo)本中微量物質(zhì)抗原+抗體抗原抗體復(fù)合物

Ag+Ab

Ag*Ab三、固相免疫測定B與F分離

Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*

Ab

Ab四、固相膜的特點多孔性

毛細(xì)管作用非共價鍵高度吸附抗體或抗原

高度敏感性易于漂洗

操作簡便五、常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜尼龍(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜六、固相膜的技術(shù)要求孔徑：0.2~0.6μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白質(zhì)結(jié)合力：吸附力很強，以μg/cm2表示均一性固相NC膜第二節(jié)免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold

labelling

techique)

是以膠體金作為標(biāo)記物的免疫標(biāo)記技術(shù)?；驹碛媒鹑苣z標(biāo)記蛋白質(zhì)，膠體金顆粒具有高電子密度的特性，故在金標(biāo)蛋白的抗原抗體結(jié)合處，顯微鏡下可見黑褐色顆粒；當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的標(biāo)記處大量聚集時，可在載體膜上呈現(xiàn)肉眼可見紅色或粉紅色斑點，從而用于抗原或抗體物質(zhì)的定位或定性。膠體金（colloidalgold）指金微小粒子（1－100nm）分散在溶液中所形成的金溶液。是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。也稱金溶膠（goldsolution）。技術(shù)類型：1.金免疫測定技術(shù)

2.金免疫組化技術(shù)一、膠體金制備

膠體金（colloidalgold）的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液。

膠體金的制備方法

原理：向一定濃度的氯金酸溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子，形成金顆粒懸液。

配HAuC14水溶液加熱沸檸檬酸三鈉攪動加熱沸（約2～3min*）冷卻加蒸餾水至原體積。見淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。通過改變檸檬酸鈉的用量可制得不同大小的膠體金顆粒

膠體金的制備及特性膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性（nm)（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙紅色522411.00紅色52571.50.70紫色535*還原100ml0.01%HAuCl4所需量

制備膠體金的注意事項（1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。（2）氯金酸對金屬有強烈的腐蝕性，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3）制備膠體金應(yīng)用雙蒸/三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。（4）玻璃容器必須是絕對清潔的，最好是經(jīng)硅化處理的。

膠體金的保存潔凈的玻璃器皿中可較長時間保存；少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。膠體金的鑒定：肉眼、分光光度計、電鏡等方法觀察應(yīng)為清亮透明的液體若膠體金混濁或液體表面有漂浮物，則制備的膠體金有較多的凝集顆粒膠體金（ColloidalGold）

15~60nm優(yōu)質(zhì)劣質(zhì)免疫金的制備免疫金（immunogold）：是指膠體金與抗原或抗體等的結(jié)合物,在免疫組織化學(xué)技術(shù)中，習(xí)慣上要稱之為金探針。制備方法：

1.膠體金溶液的pH值調(diào)整

2．蛋白質(zhì)最適標(biāo)記量的確定

3．標(biāo)記過程

4．離心去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，反復(fù)洗滌2～4次

5.免疫金最終用稀釋液配成工作濃度保存

膠體金結(jié)合物（Conjugate）膜固相免疫測定的特點第三節(jié)膜載體免疫測定的種類與原理優(yōu)點不足之處簡便，快速敏感度略低，價格略高（與ELISA比）單份測定精密度較差，質(zhì)控困難保存期長（優(yōu)質(zhì)試劑）穩(wěn)定性較差（普通試劑）可測定物范圍廣（主要為定性試驗）不易制備定量、半定量試劑感染性疾病的診斷妊娠、排卵的診斷腫瘤標(biāo)志；心肌標(biāo)志；濫用藥物固相微孔膜測定種類斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)免疫層析試驗（immunochromatographyassay,ICA）斑點ELISA

(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

免疫印跡法(immunoblottingtest,IBT)

放射免疫沉淀試驗(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)

一、斑點金免疫滲濾試驗

（dotimmunogodl

fitration

assay,DIGFA

原理：將抗原或抗體點加在固相載體NC膜上，制成的包被微孔濾膜貼置于吸水材料上，依次滴加在膜上的標(biāo)本、免疫金、及洗滌液等液體很快滲入吸水材料中，最后陽性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色斑點。

特點：快速、簡便、經(jīng)濟、無需特殊設(shè)備、已成為床邊檢測的主要方法之一。技術(shù)要點：技術(shù)類型：①雙抗體夾心法Ab

＋Ag（標(biāo)本）＋金標(biāo)抗體洗滌膜中央形成紅色斑點

②間接法Ag＋Ab（標(biāo)本）洗滌＋金標(biāo)抗抗體洗滌膜中央形成紅色斑點一、免疫滲濾測定(IFA)操作示意圖裝置分解圖蓋微孔膜吸水墊料底

DIGFA原理圖（三）技術(shù)要點1.試劑盒組成滴金反應(yīng)板、塑料小盒、吸水墊料、包被了抗原或抗體的硝酸纖維素膜、膠體金標(biāo)記物、洗滌液2.操作要點孔內(nèi)滴加標(biāo)本，待完全滲入?？變?nèi)滴加膠體金標(biāo)記抗體，待完全滲入?？變?nèi)滴加洗滌液，待完全滲入。膜中央呈現(xiàn)紅色或粉紅色斑點為陽性。斑點深淺相應(yīng)提示陽性強度。IFA——雙抗體夾心法測抗原AB加尿樣AC

陰性

陽性加膠體金標(biāo)記抗體C

斑點金免疫滲濾試驗(IFA)除去濾器BD加洗滌液加尿樣A加尿樣AGIFA技術(shù)的發(fā)展（間接法測抗體）陽性陰性固相膜固相抗原待測抗體金標(biāo)記抗人IgG抗體人IgG固相抗人IgG抗體快速檢測（滲濾法）原理圖IFA——結(jié)果判斷特點

NC膜對蛋白類物質(zhì)有很強的吸附作用，容易使Ag或Ab包被，封閉后，加待檢標(biāo)本、酶標(biāo)Ab、酶不溶性底物，陽性標(biāo)本呈斑點顯色。原理是用膠體金標(biāo)記技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)結(jié)合，以微孔濾膜為載體的快速固相膜免疫分析技術(shù)。滴加在膜一端的標(biāo)本液受載體膜的毛細(xì)管作用向另一端移動，猶如層析一般，在移動過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無關(guān)物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判定實驗結(jié)果。二、免疫層析測定immunochromatography

assay,ICA

ICA技術(shù)類型

①雙抗體夾心法

②競爭法

③間接法技術(shù)要點臨床應(yīng)用及評價

①靈敏度不及酶標(biāo)法和發(fā)光免疫測定法

②只能定性，不能作定量測定

③有“床邊檢驗”之稱

④用于正常體液中不存在或含量少物質(zhì)的測定ICA試劑條樣品墊結(jié)合物墊NC膜吸水墊DICA雙抗體夾心法原理圖金標(biāo)抗體包被抗體抗金標(biāo)抗體吸水紙標(biāo)本？？（三）技術(shù)要點1.試劑盒組成：膠體金層析條2.原理：斑點金免疫層析雙抗體夾心法3.操作要點：斑點金免疫層析試驗（一）包被兔抗鼠IgG包被鼠抗HCG單抗金標(biāo)鼠抗HCG單抗尿液浸濕標(biāo)志線

手持端包被兔抗鼠IgG包被鼠抗HCG單抗金標(biāo)鼠抗HCG單抗尿液浸濕標(biāo)志線

手持端尿樣陽性弱陽性陰性無效斑點金免疫層析試驗（二）DICA競爭法原理圖金標(biāo)抗體包被抗原抗金標(biāo)抗體吸水紙陽性結(jié)果標(biāo)本？？？？ICA——間接法測抗體ICA結(jié)果觀察

陽性陰性無效DICA間接法原理圖窗吸水材料金標(biāo)抗人IgG吸水材料吸水材料標(biāo)本加樣區(qū)包被抗原為了消除待測標(biāo)本中非特異性IgG與特異性IgG競爭結(jié)合金標(biāo)抗人IgG，故測抗體常用“反流免疫層析法”①②標(biāo)記線③④⑤合上檢測盒⑥⑥液體流動方向IFA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存4~8℃6個月室溫一年操作步驟3~51觀察時間3min3~20min陽性反應(yīng)顏色濃度操作結(jié)束顏色不變顏色逐漸加深I(lǐng)FA穿流（FLOWTHROUGH）ICA橫流（LATERALFLOW）GIFA技術(shù)的發(fā)展第一代

1988HIVCHEK（DuPont）單點，5~10分鐘，血清，金標(biāo)試劑瓶裝凍干品改進抗原HIV1+2，提高敏感度和特異性，縮短反應(yīng)時間，減少步驟，樣品多樣化。第八代INSTANTCHEKHIV1+22點（測試+控制）金標(biāo)試劑：單人份、液體樣品：血清、血漿、全血、尿液第九~十二代研制中單一試劑ICA技術(shù)的發(fā)展1990年ABBOTT公司膠體硒標(biāo)記ICA

Unipath公司CLEARVIEW立明衣原體彩色膠乳標(biāo)記ICAROCHECardiacReader

TnT

定量0.1~3ng/ml

合成TnT質(zhì)控點IFA肌紅蛋白雙孔法

S：測定孔

C：定量質(zhì)控

100μg/LIFA微量白蛋白單孔法

T：測定孔

C1：定量質(zhì)控30mg/LC2：定量質(zhì)控200mg/L

結(jié)果判定：（-）<30（+）30~100、（++）

100～200（+++）>200mg/LICA甲胎蛋白（AFP）參考值：30μg/L肝癌診斷值：>400μg/L結(jié)果判定：（-）<30（+）30~200（++）200~400（+++）>400μg/LSCTC2C1測定線對照線半定量測定臨床應(yīng)用及評價方法評價：

1.操作簡便、快捷、操作人員無需技術(shù)培訓(xùn)、不需特殊設(shè)備、試劑穩(wěn)定、便于保存，特別符合“床邊檢驗”。

2.靈敏度不及酶標(biāo)法和酶發(fā)光免疫測定法

3.不能準(zhǔn)確定量，只能定性或半定量。

4.目前主要用于正常體液中不存在的物質(zhì)（傳染病抗原或抗體、毒品等）和正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)的檢測。如：HCG、AFP三、斑點酶免疫吸附試驗

——Dot-ELISA三、斑點—酶聯(lián)免疫吸附試驗斑點—酶聯(lián)免疫吸附試驗（dot-ELISA）屬于ELISA類型，與前述的ELISA有所不同的是用吸附蛋白質(zhì)能力很強的硝酸纖維素（NC膜）作為固相載體。技術(shù)類型和方法要點1、間接法——測抗體NC膜+已知抗原干燥封閉加待測血清+酶標(biāo)抗抗體洗滌加底物2、夾心法——測抗體NC膜+待測血清干燥封閉加特異性抗原+酶標(biāo)抗體洗滌加底物3、雙抗體夾心法——測抗原NC膜+特異性抗體干燥封閉加待測血清+酶標(biāo)抗體洗滌加底物4、直接法——測抗原NC膜+待測血清干燥封閉加酶標(biāo)抗體洗滌加底物有染色斑點（+）無染色斑點（—）有染色斑點（+）無染色斑點（—）有染色斑點（+）無染色斑點（—）1~2ul2~5ul1~2ul2ul有染色斑點（+）無染色斑點（—）方法評價①操作簡便快速，結(jié)果判定不需特殊設(shè)備，適合基層使用。②特異性強，敏感性較ELISA高6~8倍③試劑用量少，較ELISA節(jié)約5~10倍④檢測結(jié)果可長期保存，利于復(fù)查；⑤本法只能做定性分析，不能做定量測定。四、酶聯(lián)免疫斑點試驗

——ELISPOT20世紀(jì)80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌B細(xì)胞和細(xì)胞因子分泌T細(xì)胞的酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)。

ELISPOT檢測原理

細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過CTL公司生產(chǎn)的ELISPOT酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。ELISPOT分析儀解決以下問題哪些斑點是抗原特異性T細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點具有進一步分析價值），哪些是無關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點沒有T細(xì)胞研究價值）斑點大小的意義在對不同細(xì)胞因子計數(shù)和分析時，如何定義斑點最大和最小尺寸如何從單個細(xì)胞基礎(chǔ)上分析實驗精確度有多高？如果一個細(xì)胞產(chǎn)生相似的細(xì)胞因子，在多大程度上會干擾分析結(jié)果？幾次重復(fù)實驗才能使結(jié)果更有意義？E