綜述人血內(nèi)皮祖細胞

PAGEPAGE6作者簡介：馬良龍，男，1971年生，陜西蒲城人，主治醫(yī)師，在讀博士。主攻方向：組織工程血管構(gòu)建的實驗研究及復(fù)雜先天性心臟病的外科治療。陳君柱人血中內(nèi)皮祖細胞研究現(xiàn)狀馬良龍綜述黃惠民審校上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心胸心外科200127摘要：人循環(huán)血液中存在內(nèi)皮祖細胞，可以分化成內(nèi)皮細胞和/或平滑肌細胞，其主要功能是參與血管新生。目前，確定內(nèi)皮祖細胞還沒有一個統(tǒng)一的標準，相對認可為內(nèi)皮祖細胞的是CD34、AC133和FLK-1等標志陽性細胞。內(nèi)皮祖細胞在缺血性疾病治療、血管組織工程、靶向藥物治療、腫瘤治療等方面有廣泛應(yīng)用前景。本文總結(jié)近幾年有關(guān)其來源、鑒定、分化、功能、應(yīng)用等方面的文獻。關(guān)鍵詞：內(nèi)皮祖細胞血管新生組織工程干細胞具有自我更新和多向分化潛能，分胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞為全能干細胞，可以誘導(dǎo)分化成體內(nèi)幾乎所有類型細胞。而成體干細胞為多能干細胞，只能在一定刺激因子和特定的微環(huán)境下分化成幾種細胞或具有特定功能的組織、器官。成體干細胞存在于骨髓、臍帶血、外周血以及胎肝中。由于受到倫理、法律及宗教文化等多方面問題的限制，胚胎干細胞的研究開展受到很大影響。而成體干細胞研究不存在這些問題，發(fā)展較快。目前干細胞臨床應(yīng)用最廣泛和成熟的是骨髓移植和外周血干細胞移植，主要應(yīng)用于血液病和各種惡性腫瘤引起的惡性貧血、免疫力低下等。其它方面的應(yīng)用多處于實驗研究階段。在心血管外科，干細胞在組織損傷和缺損修復(fù)中的作用、在構(gòu)建組織工程材料的應(yīng)用是目前研究的重點。文獻中多應(yīng)用endothelialprogenitorcells或angioblast/hemangioblast及endothelialprocursor來描述最后發(fā)育成內(nèi)皮細胞的前體細胞（1,2,3,4,5,6），一般翻譯成內(nèi)皮祖細胞、成血管母細胞、血液成血管細胞和內(nèi)皮前體細胞。干細胞和祖細胞的特性為：干細胞具有自我更新和多向分化能力，具有“永生”特性，祖細胞只能在一定條件下分化成一種或兩種特定細胞，沒有自我更新能力，只能由干細胞的分化來補充其衰老死亡的細胞，屬于過渡階段的一種細胞，它不一定具有所有成熟細胞的標志，而且?guī)в胁糠制渌愋图毎臉酥?。除個別文獻明確定義了內(nèi)皮祖細胞（5）外，大多文獻中并沒有做到這一點。所以不同文獻不同作者所提到的內(nèi)皮祖細胞并不一定指的是同一類細胞。有作者（7）用同一種來源細胞，先體外培養(yǎng)擴增3周，后續(xù)培養(yǎng)采用不同方法先后培養(yǎng)出內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞。本文文獻中所提到的細胞都屬于此類細胞。由于骨髓采集需要麻醉且較痛苦，不易為人們接受，所以我們重點總結(jié)血液循環(huán)中內(nèi)皮祖細胞存在證據(jù)、來源、分化、功能及應(yīng)用研究等方面的文獻。1外周血內(nèi)皮祖細胞存在的證據(jù)MosesHong-DeWu等（21）報道一例65歲男性胸主動脈瘤患者，移植內(nèi)徑10毫米Dacron血管。26月后由于移植物周圍巨大血清腫而行二次手術(shù)，取出移植的血管后經(jīng)病理切片及內(nèi)皮、平滑肌細胞標記鑒定證實，移植物內(nèi)腔有平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞覆蓋，而且遠離吻合口血管翳范圍。根據(jù)Fallout分析，移植物內(nèi)腔被覆細胞來源有三種可能，即吻合口附近原血管壁細胞增生爬行、間質(zhì)細胞內(nèi)侵、血液中循環(huán)內(nèi)皮祖細胞黏附增殖。此例由于巨大血清腫的存在，排除間質(zhì)細胞內(nèi)侵；遠離吻合口血管翳除外吻合口附近原血管壁細胞爬行可能，因此斷定移植物內(nèi)腔被覆細胞來源于血液循環(huán)中內(nèi)皮祖細胞。NoelM.Caplice等（8）做過一組尸體解剖，所有尸體均為骨髓移植后存活超過一月后死亡者。在性別不符的有血管硬化發(fā)生的女性尸體，其血管病變處Y染色體陽性平滑肌細胞數(shù)是無血管硬化者的100倍。由于Y染色體陽性細胞只能來源于骨髓，據(jù)此推斷，骨髓中的內(nèi)皮祖細胞增生后進入血液循環(huán)，在某種因素影響下在病變部位黏附、增殖，參與血管硬化病變的形成。在性別相配的骨髓移植病人（22），移植成功后5－20月取血樣作外周血內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)，用免疫磁珠選擇法檢測P1H12+細胞。體外培養(yǎng)4周后發(fā)現(xiàn)，早期的內(nèi)皮細胞表型以受體為主，而后期以供體表型為主，而且供體表型細胞的增長能力超過受體表型細胞1000倍，說明血液循環(huán)中存在內(nèi)皮祖細胞，來源于骨髓。2臍帶血中內(nèi)皮祖細胞存在的證據(jù)無論是單純分離單核細胞（5,20,27）,還是經(jīng)過免疫磁珠篩選（5,16,20,30）細胞，臍帶血在一定培養(yǎng)液和刺激因子存在下，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后，鏡下都出現(xiàn)梭形黏附型細胞，成群細胞排列呈鵝卵石樣。內(nèi)皮特異性標志VEGFR-2、VIII因子鑒定陽性，內(nèi)皮細胞功能鑒定如ac-LDL攝取、eNOS分泌能力也證明為內(nèi)皮細胞。這些實驗均揭示臍帶血中存在內(nèi)皮祖細胞。而且臍帶血中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量和擴增能力明顯較成人血高。3內(nèi)皮祖細胞的來源如上所述（8,22）,血管移植物內(nèi)腔被覆的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞的來源有三種方式：即間質(zhì)細胞由外侵入、附近細胞移行和血液循環(huán)中的內(nèi)皮祖細胞。由于排除了間質(zhì)細胞內(nèi)侵和附近細胞移行的可能，只能確定它們來源于循環(huán)的內(nèi)皮祖細胞。而這些細胞的表型為Y染色體陽性或表現(xiàn)為供體表型，提示血液循環(huán)中的內(nèi)皮祖細胞來源于骨髓。一般認為，骨髓中的內(nèi)皮祖細胞擴增或進入血液循環(huán)后擴增，然后分化、移行到移植物表面，黏附增殖。4內(nèi)皮祖細胞的分離鑒定內(nèi)皮祖細胞的鑒定程序一般如下：用密度梯度離心法分離單核細胞，或用免疫磁珠吸附分離法，或兩種方法結(jié)合應(yīng)用,分離出目標細胞群。然后體外擴增或直接誘導(dǎo)分化出黏附型細胞，鑒定所得細胞為內(nèi)皮細胞或平滑肌細胞。細胞鑒定分形態(tài)、功能及特異性細胞標志鑒定三方面。典型內(nèi)皮細胞為梭形或多角形，核呈橢圓形。成群細胞呈現(xiàn)“鵝卵石”樣排列。內(nèi)皮細胞的表面標志有VEGF-2、VE-Cadherin、FLK-1及VIII因子。功能鑒定通過分析ac-LDL攝取能力、eNOS及前列腺素E分泌能力。平滑肌細胞為長梭形，細胞核成扁圓形，成群的細胞表現(xiàn)為“峰與谷”樣排列。平滑肌細胞標志為平滑肌α－肌動蛋白、平滑肌重鏈和Calponin。只要目標細胞群最終分化出內(nèi)皮細胞和/或平滑肌細胞，就可以肯定為內(nèi)皮祖細胞。KathyjoA等（15）常規(guī)分離FLT-1+成體干細胞注射給心梗模型鼠，結(jié)果心梗區(qū)內(nèi)新生血管豐富，內(nèi)皮細胞數(shù)量明顯增多，說明分離所得成體干細胞中有內(nèi)皮祖細胞。不同文獻提出的內(nèi)皮祖細胞標志不同。最常見且比較得到公認的是CD34（5,7,15,17,20,22,24,25,28,29）。大多學(xué)者認為CD34+細胞為造血干細胞和內(nèi)皮祖細胞共同祖先細胞，二者為共同起源細胞，這和胚胎發(fā)育中心血管系統(tǒng)和血液系統(tǒng)發(fā)育來自一個血島相符。另外AC133、FLK-1、P1H12也是相對得到認可的內(nèi)皮祖細胞標志（6,22,25,29,30）。但有作者提出不同看法，MagedHarraz等（24）在同一批實驗過程中發(fā)現(xiàn)，CD34－細胞在條件培養(yǎng)液（培養(yǎng)過CD34+細胞的培養(yǎng)液）中逐漸分化出內(nèi)皮細胞，因此認為CD34+細胞分泌某些未知因子刺激CD34－細胞向內(nèi)皮細胞分化。JaleesRehman等（26）從單核細胞CD14+AC133－細胞誘導(dǎo)分化出內(nèi)皮細胞。還有從單核巨噬細胞中誘導(dǎo)分化出內(nèi)皮細胞的報道（16,24,26,28）?？傊瑑?nèi)皮祖細胞還沒有一個統(tǒng)一的標志標準，相對認可為內(nèi)皮祖細胞的是CD34、AC133和FLK-1等標志陽性細胞。5內(nèi)皮祖細胞的體外培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞對培養(yǎng)液的要求較高，必須用特殊配方培養(yǎng)液。一般內(nèi)皮祖細胞所用的培養(yǎng)液是EGM-2（又稱EBM-2），少數(shù)情況下應(yīng)用IMDM（29）、RPMI1640（20）、長周期培養(yǎng)液（long-termculturemedium）（30）、Medium199（23）和條件培養(yǎng)液（24）。無論那種培養(yǎng)液，加入一定的刺激因子，都能誘導(dǎo)分化出典型的內(nèi)皮細胞和/或平滑肌細胞。內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng)需要VEGF、bFGF（堿性纖維生長因子）等多種刺激因子存在。可能還需要許多未知因子。當(dāng)黏附細胞量較少時，培養(yǎng)液中加入一定數(shù)量單核細胞有促進黏附細胞生長作用，可能機理就是細胞之間通過接觸傳遞某種信號或分泌了某些未知因子。應(yīng)用條件培養(yǎng)液或添加胎牛血清、牛腦提取物等進行細胞培養(yǎng)就是考慮到可能存在一些未知的生長因子。6內(nèi)皮祖細胞的動員和誘導(dǎo)分化6.1誘導(dǎo)分化內(nèi)皮細胞無論胚胎干細胞還是成體干細胞，其誘導(dǎo)分化都需要一定的微環(huán)境。內(nèi)皮祖細胞也同樣如此，相同的培養(yǎng)液加不同的刺激因子可產(chǎn)生不同的分化結(jié)果，而相同的刺激因子在不同的培養(yǎng)液里造成的分化結(jié)果卻可能相同（20,24）。例如同樣一個人外周血中CD14+CD34+CD45+細胞在RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，加入IL-2誘導(dǎo)分化出T淋巴細胞，加入上皮生長因子誘導(dǎo)成上皮細胞，加入VEGF則誘導(dǎo)出內(nèi)皮細胞，而加入脂多糖則可誘導(dǎo)出巨噬細胞（28）。有關(guān)影響內(nèi)皮祖細胞向內(nèi)皮細胞分化的研究很多，影響因子也是各種各樣。其中必不可少的關(guān)鍵因素是VEGF(1,5,7,10,13,14,26,29)。一般認為VEGF通過細胞膜上的VEGFR-2受體，激動蛋白激酶B，再通過三磷酸肌醇激活后續(xù)的各種細胞內(nèi)信號，啟動細胞的生長分化。血漿VEGF水平與循環(huán)內(nèi)皮祖細胞數(shù)量明顯相關(guān)。其它促使內(nèi)皮祖細胞向內(nèi)皮細胞分化不可缺少的因素有堿性纖維生長因子、上皮生長因子、肝細胞生長因子及胰島素樣生長因子。6.2誘導(dǎo)分化平滑肌細胞誘導(dǎo)分化人平滑肌細胞的文獻極少。DavidSimper等（7）首次報道了人外周血內(nèi)皮祖細胞誘導(dǎo)分化平滑肌細胞成功。他們?nèi)∏嗄杲】等送庵苎?，通過密度梯度離心和CD34VE-Cadherin免疫磁珠法分離出CD34+VE-Cadherin+細胞，先在EGM-2培養(yǎng)液中擴增3周，然后加入PDGF-BB,再培養(yǎng)兩周內(nèi)就分化出典型的平滑肌細胞。僅用重力梯度離心法分離單核細胞后用相同的方法培養(yǎng)、誘導(dǎo)細胞，所得結(jié)果相同。說明PDGF-BB是誘導(dǎo)刺激內(nèi)皮祖細胞向平滑肌細胞分化的關(guān)鍵因子。6.3影響血中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量的因素促紅細胞生成素刺激外周血內(nèi)皮祖細胞的增生（4）。在缺血性心臟病患者，應(yīng)用促紅細胞生成素后血中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量增多，且與血漿促紅細胞生成素水平成正比，體外培養(yǎng)證實可分化成內(nèi)皮細胞的細胞數(shù)量明顯增多。在接受順鉑+表阿霉素+環(huán)磷酰胺+粒細胞系刺激因子（G-CSF）或是環(huán)磷酰胺+表阿霉素+足野乙甙進行化療的病人中（11），當(dāng)白細胞數(shù)量超過5×105/ml后采血，血中采集到的內(nèi)皮祖細胞數(shù)量明顯較化療前增多，說明這些化療藥物有動員外周血內(nèi)皮祖細胞作用。HMG-CoA還原酶抑制劑statins也能刺激血中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量，估計其作用機理類似VEGF，通過蛋白激酶B途徑起作用（10）。其它增加外周血中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量的刺激因子還有G-CSF(29)、單核巨噬細胞系刺激因子（CM-CSF）（26,29）、PDGF(27)。缺血缺氧（23）明顯誘導(dǎo)循環(huán)中內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量。通過鼠眼及肢體缺血模型實驗證實，經(jīng)過缺血處理的鼠血中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量明顯增加，缺血區(qū)內(nèi)皮細胞標志陽性，出現(xiàn)大量新生血管。JanathanM.Hill等（18）通過分離靜脈血單核細胞進行體外培養(yǎng)，根據(jù)所獲得內(nèi)皮細胞數(shù)量分析其相關(guān)影響因素，認為高血壓、糖尿病、高酯血癥是減少血中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量的主要因素。7內(nèi)皮祖細胞的功能內(nèi)皮祖細胞的功能主要體現(xiàn)在其能在一定條件下，在機體缺血區(qū)、組織損傷部位形成新生血管，促進血流恢復(fù)和創(chuàng)傷修復(fù)。大量實驗（6,12,25）通過各種方法證實內(nèi)皮祖細胞在腫瘤生長過程、肉芽形成過程、心肌及肢體缺血恢復(fù)過程中形成大量新的血管網(wǎng)，而且血液內(nèi)皮祖細胞數(shù)量與新生血管密度明顯相關(guān)。8內(nèi)皮祖細胞的應(yīng)用研究8.1心肌梗塞治療AtsuhikoKawamoto等（3）分離人外周血內(nèi)皮祖細胞，體外擴增4周后注射進心肌梗塞模型鼠，觀測結(jié)果揭示心梗面積減少，左室功能改善，心肌毛細血管密度明顯增加。說明注射外周血內(nèi)皮祖細胞可以治療心肌梗塞。KathyjoA.Jackson等（15）做了類似實驗，獲得類似結(jié)果。8.2肢體缺血治療鼠肢體缺血模型實驗揭示（1,2），無論用人血內(nèi)皮祖細胞還是轉(zhuǎn)染VEGF基因的內(nèi)皮祖細胞注射，都會明顯改善患病鼠的預(yù)后，肢體壞死、自截肢現(xiàn)象顯著減少，病理檢測缺血肢體內(nèi)新生血管明顯增多。尤其轉(zhuǎn)染VEGF基因的內(nèi)皮祖細胞注射治療作用明顯，治療所需細胞數(shù)量減少30倍左右，間接說明VEGF有動員內(nèi)皮祖細胞作用。將人外周血內(nèi)皮祖細胞體外培養(yǎng)擴增后應(yīng)用于兔肢體缺血治療，也取得相似結(jié)果(25)。在成人嚴重肢體缺血性疾病患者，應(yīng)用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染人VEGF基因后肌肉注射后，血漿VEGF暫時性高水平，病人癥狀明顯改善，而且血液離體培養(yǎng)揭示單位血內(nèi)內(nèi)皮祖細胞數(shù)量是空白對照組的30倍（13）。因為VEGF動員骨髓內(nèi)皮祖細胞，大量釋放入血并繼續(xù)擴增，內(nèi)皮祖細胞數(shù)量及活性明顯增加，促進缺血肢體內(nèi)新血管生成。據(jù)此推測內(nèi)皮祖細胞在人體缺血性心臟疾病中也應(yīng)有治療作用。8.3基因工程中作為基因載體IvaguroH（1）等給鼠內(nèi)皮祖細胞轉(zhuǎn)染人VEGF基因，使其分泌VEGF，注射給無胸腺鼠后其血漿VEGF水平升高，缺血區(qū)新血管迅速生成，毛細血管密度顯著增加，血流恢復(fù)明顯，顯著提高了注射內(nèi)皮祖細胞的治療效果,說明內(nèi)皮祖細胞可作為基因載體，尤其由于內(nèi)皮祖細胞主要參與新生血管生成，那么在血管新生旺盛組織，如腫瘤、肉芽組織、心肌缺血區(qū)等處，給內(nèi)皮祖細胞轉(zhuǎn)染治療基因，就會隨新血管生成同時發(fā)揮治療作用。8.4參與組織工程血管的構(gòu)建血管內(nèi)膜完整的內(nèi)皮細胞層具有抗血栓形成、防止血小板黏附、防止白細胞黏附和阻止平滑肌細胞增生功能。已經(jīng)公認血管內(nèi)膜平滑肌細胞增生是血管硬化的主要原因之一，所以保持血管內(nèi)皮細胞層完整對于維持血管通暢、防止狹窄非常重要。應(yīng)用組織工程方法構(gòu)建血管的關(guān)鍵之一就是使構(gòu)成的血管具有完整的內(nèi)皮細胞層。由于血液中內(nèi)皮祖細胞取材方便，容易接受，而且其擴增能力明顯較成熟細胞強，使其有可能作為種子細胞應(yīng)用于組織工程血管構(gòu)建。MichaelBoyer等（24）應(yīng)用脈沖式生物反應(yīng)器種植內(nèi)皮祖細胞于內(nèi)徑4毫米的ePTEE內(nèi)腔，4天后內(nèi)皮細胞覆蓋面積達到82％。應(yīng)用內(nèi)皮祖細胞構(gòu)建組織工程血管的動物實驗也取得顯著效果。HeH等（11）取外周血內(nèi)皮祖細胞種植于I型膠原支架上，應(yīng)用聚乙烯膜包繞成血管，移植進動物體內(nèi)，1－3月內(nèi)移植血管全部保持通暢，僅見中層有少量平滑肌細胞，外層有少量纖維細胞。而SunjayKaushal等（23）種植外周血內(nèi)皮祖細胞于脫細胞基質(zhì)構(gòu)建組織工程血管，移植于羔羊體內(nèi)后觀測，4例未種植細胞組中3例于術(shù)后5天內(nèi)堵塞，1例15天后取出時發(fā)現(xiàn)管腔已堵塞50％。而實驗組7例，分別自術(shù)后15－130天取出，所有血管均保持通暢。15天時取出血管有單層完整內(nèi)皮細胞融合，但有輕微血栓，血栓中央為雜細胞聚集。標記的內(nèi)皮細胞覆蓋面積15天－130天依次為80％－10％。管腔通暢而標記細胞減少的原因可能是標記細胞脫落、細胞分裂增生使標記物濃度逐漸減少、或是熒光標記物的衰減造成。總之，無論人臍帶血還是外周血中均存在內(nèi)皮祖細胞。臍帶血中數(shù)量較外周血多。人血內(nèi)皮祖細胞來源于骨髓，主要起血管新生作用。一般CD34+、CD133+、FLK-1+細胞可視為內(nèi)皮祖細胞。其應(yīng)用研究包括治療各種缺血性疾病，用作基因載體和在構(gòu)建組織工程血管時作種子細胞。目前研究方向集中在來源鑒定、誘導(dǎo)分化方法探索、組織工程血管構(gòu)建及作為治療方法治療缺血性疾病的探索。參考文獻：IwaguroH,YamaguchiJ,KalkaC,etal.Endothelialprogenitorcellvascularendothelialgrowthfactorgenetransferforvascularregeneration.Circulation.2002Feb12;105(6):732-8.KalkaC,MasudaH,TakahashiT,etal.Transplantationofexvivoexpandedendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularization.ProcNatlAcadSciUSA.2000;97:3422–3427.AtsuhikoKawamoto,Heon-CheolGwon,;HidekiIwaguro,et,al.TherapeuticPotentialofExVivoExpandedEndothelialProgenitorCellsforMyocardialIschemia.Circulation2001;103:634-636.HeeschenC,AicherA,LehmannR,et,al.,Erythropoietinisapotentphysiologicstimulusforendothelialprogenitorcellmobilization.Blood.2003Aug15;102(4):1340-6.JulianeEggermann,StefanieKliche,GergelyJarmy,et,al.Endothelialprogenitorcellcultureanddifferentiationinvitro:amethodologicalcomparisonusinghumanumbilicalcordblood.CardiovascularResearch,Vol.58(2)(2003)pp.478-486.MoraymaReyes,ArkadiuszDudek,BalkrishnaJahagirdar,et,al.Originofendothelialprogenitorsinhumanpostnatalbonemarrow.J.Clin.Invest.109:337–346(2002).DavidSimper,PaulG.Stalboerger,;CarmeloJ.Panetta,et,al.SmoothMuscleProgenitorCellsinHumanBloodCirculation.2002;106:1199-1204.NoelM.

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