高中生物PCR集錦

高考生物PCR的過程及應用考點歸納總結(jié)

一、基礎考點

1.名稱：多聚酶鏈式反應

2.原理：DNA雙鏈復制（DNA的半保留復制）、DNA的熱變性原理

3.前提：要有一段已知目的基因的核昔酸序列

4.過程：PCR由變性一退火一延伸三個基本反應步驟構(gòu)成:會解釋三個步驟

①變性：當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈

②復性：當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈結(jié)合;

③延伸：當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核昔酸再耐高溫的DNA聚

合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配原則合成新的DNA鏈

④重復：第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪的模板：重復循環(huán)變性一復性一延伸三過

程。

5.PCR反應體系的成分及作用

DNA模板：從樣本或細胞中提取的微量總DNA

原料：dNTP（dATP、dGTP、dCTP、TTP）,提供原料和能量

酶：Taq聚合酶（熱穩(wěn)定DNA聚合酶，從嗜熱菌中分離得到）

引物：一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸

（注意：引物與目的DNA片段兩條母鏈各自的3,端序列互補）

Mg2+：維持酶活性所必需

PCR緩沖液：維持pH,保護Taq酶

6.DNA在體內(nèi)復制的條件

模板：DNA分子的每條鏈

酶：解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶

原料、能量:dATP、dGTP、dCTP、dTTP

引物：RNA引物，溫和的反應條件

7.總結(jié)：PCR與體內(nèi)DNA分子復制的不同點:

PCRDNA復制

復制起點無有

復制叉無有

場所及條件體外；體內(nèi)細胞核、線粒體、葉綠體；

控制3個不同溫度溫和條件

步驟變性、退火、延伸起始、延伸、終止

酶Taq酶解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶

引物2種，一小段與DNA母鏈的多種RNA做引物；自行合成

一段堿基序列互補配對的

短單鏈DNA；人工合成

引物是否去除否是

變性的條件90℃以上的高溫解旋酶

結(jié)果短時間內(nèi)快速擴增目的基復制完整的DNA分子

因片段

特點

；,LLLL收

5,______一二二七

半保留復制半保留復制

兩條鏈連續(xù)合成半不連續(xù)復制

8.PCR技術(shù)在基因工程中的應用:

(1)特異性、快速擴增目的基因獲取目的基因

(2)目的基因的檢測與鑒定

9.用PCR技術(shù)可以擴增mRNA嗎？

不可以；在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，需以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則合成

cDNA再進行擴增

10.提取mRNA擴增目的基因的過程：

RNA鏈DNA鏈

RNA單鏈雜交雙鏈單鏈DNA雙鏈DNA”

舟篙5(可70~75七

1f?(<******④r—

55~60°C—

第一步：逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜

交分子

第二步：核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；

第三步：以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈,

形成雙鏈DNA分子

第四步：以雙鏈DNA分子為模板，經(jīng)過③變性、④復性、⑤延伸，循環(huán)擴增形成

目的基因產(chǎn)物

11.cDNA中缺少真核生物基因的哪些結(jié)構(gòu)：

啟動子、內(nèi)含子、終止子

12.目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是：

Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活

13.PCR產(chǎn)物的影響因素：模板DNA的量、脫氧核甘酸的量、引物的量、酶的數(shù)

量和活性、循環(huán)次數(shù)、Mg?+的濃度

14.PCR后期，反應速率下降的原因：酶的活性降低、引物和dNTP濃度降低、反

應產(chǎn)物增多

15.變性溫度過低會導致雙鏈不能充分解開；

16：PCR擴增中預變性的目的：

預變性破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級結(jié)構(gòu)。使DNA充分變性解旋為單鏈，

有利于引物與模板的正確結(jié)合

17.PCR反應體系實際操作時，加入的是4種脫氧核昔三磷酸（dATPdGTPdCTP

dTTP）,每摻入一個核昔酸，伴隨著兩個特殊化學鍵（高能磷酸鍵）的斷裂，由此

釋放的能量滿足核昔酸聚合反應的需求

18.內(nèi)參蛋白的作用：排出細胞取樣、實驗操作等對實驗結(jié)果的影響

（內(nèi)參蛋白是用來確保蛋白上樣量一致性，量化目的蛋白的表達情況，是對實驗

結(jié)果定量分析或定性比較的重要標尺）

19.內(nèi)參蛋白的選擇：細胞內(nèi)穩(wěn)定存在和高表達的蛋白質(zhì)

二、有關引物的考點總結(jié)：影響PCR的各種因素中，引物的設計最為重要

1.引物的作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3,端開始延伸DNA鏈

2.需要引物的原因：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從3'端延伸DNA

鏈，因此DNA的復制需要引物

3.設計兩種引物的原因：基因的兩條反向平行鏈都做模板，其堿基序列不同，且

DNA聚合酶只能從3,端延伸子鏈，用2種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴增

4.需要大量引物的原因：子鏈是在引物的引導下合成的，引物隨子鏈DNA數(shù)量的

增多而被消耗

5.需要引物的數(shù)量：（2J1）X2

若擴增4次，共產(chǎn)生坨個DNA時，消耗地個引物。

6.PCR擴增的產(chǎn)物的特異性：由引物的特異性決定；引物是根據(jù)目的基因兩端的

核甘酸序列設計的

例：PCR技術(shù)擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據(jù)是有一段已知干擾素

基因的核昔酸序列。

例：（2020山東高考）通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性的擴增出Wx基因的

cDNA,原因是。

答案：引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設計合成的（或：引物能與Wx基因的

cDNA特異性結(jié)合）

7.兩引物間固定長度（等長）的DNA序列在PCR擴增1次后首先出現(xiàn)

8.復制方向：是沿子鏈5,一3"從引物的3,端延伸子鏈

9.）如果需要在引物上加限制酶的識別序列：需要在引物的5,加

10.在引物的5,端設計兩種限時酶識別序列的原因：便于目的基因和載體的定向

正確連接

注：

（1）引物的5'端可以修飾，引物的5'端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特

異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5'端修飾包括:

加酶切位點，加標記熒光，引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子

序列等。

（2）引物的3'端不可修飾；引物的延伸是從3'端開始的，不能進行任何修飾。

11.設計引物時，引物自身不能有堿基互補配對的序列：避免引物自連，不能得到

目的產(chǎn)物

12.設計引物時，兩引物之間不能有堿基互補配對的序列：防止兩引物之間結(jié)合

形成雙鏈，降低引物與DNA模板鏈結(jié)合的效率

13.引物設計不能太短：防止非目的基因的獲得

例：為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，設計引物時需要增加適當?shù)奈稽c。設計引物

時需要避免引物之間形成，而造成引物自連。

（答案：限制酶堿基互補配對）

例：為便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的端加上限制性

酶切位點，且常在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是

(答案：5'使DNA片段能定向插入表達載體，減少自連)

14.復性的溫度取決于：引物的長度、堿基組成、濃度及靶基因序列的長度。如果

引物中GC含量較高，可適當提高退火溫度

15.復性溫度過高，得不到產(chǎn)物的原因：引物不能穩(wěn)定的與模板結(jié)合

16.延伸溫度過高不利于引物與模板鏈的結(jié)合；

17.延伸的時間根據(jù)待擴增片段長度而定，延伸時間過長會導致非特異性擴增。

例：進行擴增時，反應的溫度和時間需根據(jù)具體情況進行設定，下列選項中

的設定與引物有關，—的設定與擴增片段的長度有關。

①變性溫度②退火溫度③延伸溫度

④變性時間⑤退火時間⑥延伸時間

答案：②⑥

18.退火溫度過高會導致引物不能充分與模板鏈結(jié)合，導致目標產(chǎn)物的量減少

三、PCR技術(shù)與電泳技術(shù)結(jié)合的相關考點總結(jié)：選擇性必修三P84

1.方法：瓊脂糖凝膠電泳一鑒定并分離DNA

2.原理：DNA具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團可以帶上正電荷或負

電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動

3.遷移速率的影響因素：凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象

(1)凝膠濃度：凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，

DNA遷移受到的阻力越大，速率越慢，離點樣孔越近；根據(jù)分離DNA片段的大小，

用電泳緩沖液配置瓊脂糖溶液，濃度0.8%-1.2%(瓊脂糖溶液加熱融化、冷卻后

加核酸染料)。

(2)DNA分子的大?。篋NA的分子量越大，遷移速率越慢，離點樣孔越近

（3）DNA分子的構(gòu)象：

具有三種構(gòu)像的質(zhì)粒在瓊脂糖電泳的前后順序：環(huán)形超螺旋》線形》開環(huán)；

環(huán)形超螺旋（DNA兩條鏈都是完整的質(zhì)粒，就是超螺旋），結(jié)構(gòu)緊致，受到的阻力

小，遷移速率最快；完全斷裂的線性DNA,遷移速率次之；環(huán)形松弛（DNA雙鏈斷

了一條，質(zhì)粒DNA就失去超螺旋，成為松弛的環(huán)），遷移速率最慢

4.儀器：PCR儀、微量離心管、微量可調(diào)移液器、電泳裝置（電泳儀、水

平電泳槽等）

試劑：購買的PCR試劑盒、配方參考教材或試劑盒說明書

電泳試劑：電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖、核酸染料等

5.步驟及注意事項：

★步驟：

1.用微量移液器按照右欄中的配方活PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次

加入各種組分。

PCR反應體系的配方

10倍濃縮的擴增緩沖液5uL

20mmol/L的4種脫氧核甘酸的等量混合液1L

20mmoI/L引物I2.5uL

20mmoI/L引物112.5^L

H2028~33uL

1~5U/|1L的TaqDNA聚合酶1~2U

模板DNA510HL

總體積50^L

注：模板DNA的用量為1pg~1ug

2.待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機，離心約

10s,使反應液幾種在管的底部

3.按照下表的參數(shù)，設置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應液的微量離心管放入

PCR儀中進行反應。

循環(huán)程序變性復性延伸

預變性94℃,5min//

30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min

最后1次94℃,1min55℃,30s72℃,1min

4.根據(jù)待分離的DNA片段的大小，用電泳緩沖液配置瓊脂糖溶液，一般配置質(zhì)量

體積比為0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍

冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。

5.將溫熱的瓊脂糖溶液迅速導入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。

6.待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。

7.將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。

8.將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液

器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參

照物。

9.接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般1?5V/cm。待

指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。

10.觀察電泳鑒定結(jié)果：取出凝膠至于波長為300nm的紫外燈下觀察并照相。

★注意事項：

1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗使用的微量離心管、槍頭和蒸儲水等

在使用前必須進行高壓滅菌處理。

2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃

儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。

3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必

須更換。

4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。

★結(jié)果分析：

一次性成功的DNA片段擴增應該產(chǎn)生與預期大小一致的DNA片段。若出現(xiàn)與預期

不一致的結(jié)果，可嘗試從以下幾個方面進行分析：模板DNA的制備、引物的質(zhì)量

與特異性、酶的質(zhì)量以及PCR循環(huán)的條件。

1.未出現(xiàn)擴增條帶的原因：

(1)模板：模板DNA含有雜蛋白或Taq酶的抑制劑、模板DNA污染。

若反應系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加Taq酶以前，將反應體系95℃

加熱5?10分鐘。

(2)酶：Taq酶失活或在反應體系中未加入酶。

(3)引物：引物特異性不強，濃度不合適。檢查引物特異性或重新設計引物；引

物濃度過高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

(4)變性溫度是否準確：過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活；變性溫度低，變性時

間短則模板變性不徹底。

(5)Mg2+濃度過低,擴增的產(chǎn)物過少;

(6)4種dNTP濃度過低，擴增的產(chǎn)物過少;

(7)目的序列變異

2.擴增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)的原因：

(1)模板：模板DNA污染。確保操作的潔凈。

(2)酶：酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。

(3)引物：引物用量偏大，引物的特異性不高，或形成引物二聚體，特別是引物

的3,短互補，易形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性擴增條帶；

(4)復性溫度偏低，復性及延伸時間偏長：應提高復性溫度，減少變性與延伸時

間

(5)Mg2+濃度過高，反應特異性降低，會引發(fā)非特異性擴增

(6)4種dNTP濃度不相等：任意一種濃度過高或過低，都會引發(fā)錯配，擴增的

產(chǎn)物過少；

(7)循環(huán)次數(shù)過多

(8)延伸時間過長會導致非特異性擴增

★對照的作用：

陽性對照：用于檢測PCR體系是否正確及擴增效率，確保不是DNA凝膠和PCR

程序的問題

陰性對照：用于檢測是否存在含有目的序列的DNA污染

陰性對照出現(xiàn)條帶：試劑，槍頭，工作臺污染。

四、DNA片段的擴增及電泳鑒定實驗的問題串

1.PCR擴增的原理：

2.DNA分子帶電的原因：

3.DNA在電場中的移動方向：

4.PCR產(chǎn)物鑒定方法：

5.凝膠中DNA分子遷移速率的