T-GXAS346-2022花生中硒形態(tài)的測(cè)定高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法

ICS67.060

CCSB20

GXAS

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/GXAS346—2022

花生中硒形態(tài)的測(cè)定高效液相色譜-電感

耦合等離子體質(zhì)譜法

Determinationofseleniumspeciesinpeanutbyhighperformance

liquidchromatographyinductivelycoupledplasmamassspectrometry

2022-07-21發(fā)布2022-07-27實(shí)施

廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)發(fā)布

T/GXAS346—2022

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義.........................................................................1

4原理...............................................................................1

5試劑與材料.........................................................................1

6儀器和設(shè)備.........................................................................2

7試樣制備...........................................................................3

8分析步驟...........................................................................3

9結(jié)果計(jì)算...........................................................................4

10精密度............................................................................4

附錄A（資料性）硒混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖.................................................5

I

T/GXAS346—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由廣西大學(xué)提出、歸口并宣貫。

本文件起草單位：廣西大學(xué)、廣西西大檢測(cè)有限公司、杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院、河南科技大學(xué)、

河南艾格多科技有限公司、蘇州堯智生態(tài)環(huán)保有限公司。

本文件主要起草人：韋燕燕、沈方科、范曉蘇、顧明華、賈彥博、凌毅婷、何萬(wàn)領(lǐng)、毛彥君、袁林

喜、路丹、蔡中全。

II

T/GXAS346—2022

花生中硒形態(tài)的測(cè)定高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法

1范圍

本文件描述了高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定花生中硒形態(tài)的原理、試劑和材料、儀

器和設(shè)備、試樣制備、分析步驟、結(jié)果計(jì)算、精密度。

本文件適用于花生中硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、甲基硒代-L-半胱氨酸、硒酸鈉、亞硒酸鈉5種硒

形態(tài)的測(cè)定。硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、甲基硒代-L-半胱氨酸的方法檢測(cè)限為0.001mg/kg，硒酸鈉、

亞硒酸鈉的方法檢出限為0.002mg/kg（以Se計(jì)）。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4原理

試樣中硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、甲基硒代-L-半胱氨酸、硒酸鈉、亞硒酸鈉5種硒形態(tài)用酶提取，

經(jīng)過(guò)反相液相色譜分離，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。

5試劑與材料

5.1試劑

5.1.1以下所用試劑，除特殊注明外，均為優(yōu)級(jí)純?cè)噭?；水?yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的要求。

5.1.2七氟丁酸（C4HF7O2，98％）。

5.1.3磷酸二氫鉀（KH2PO4）。

5.1.4甲醇（CH3OH）：色譜純。

5.1.5鏈霉蛋白酶E（PronaseE，Solarbio）：酶活力=7000u/g（在pH7.5和40℃條件下，每min水

解酪蛋白產(chǎn)生7μmol酪氨酸）。

5.2材料

微孔雙層水系濾膜(PES)：47mm，0.22μm。

5.3流動(dòng)相

流動(dòng)相（30mmol/L磷酸二氫鉀—0.15％七氟丁酸—2％甲醇）：稱取8.1654g磷酸二氫鉀（KH2PO4）

(精確到0.0001g）于2L水中，攪拌至溶解，溶解后過(guò)0.22μm微孔濾膜（PES)過(guò)濾，取磷酸二氫鉀濾

液1000mL于2L潔凈廣口瓶中，加入1.5mL七氟丁酸和20mL甲醇溶液，超聲30min，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5.4標(biāo)準(zhǔn)品

5.4.1硒代蛋氨酸（化學(xué)式：C5H11NO2Se，CAS號(hào)：2578-28-1），純度≥98％。

5.4.2L-硒代胱氨酸（化學(xué)式：C6H12N2O4Se2，CAS號(hào)：29621-88-3），純度≥98％。

1

T/GXAS346—2022

5.4.3Se-甲基硒代-L-半胱氨酸(化學(xué)式：C4H9NO2Se，CAS號(hào)：26046-90-2)，純度≥98％。

5.4.4硒酸鈉（化學(xué)式：Na2SeO4，CAS號(hào)：13410-01-0），純度≥98％。

5.4.5亞硒酸鈉（化學(xué)式：Na2SeO3，CAS號(hào)：10102-18-8），純度≥98％。

5.5標(biāo)準(zhǔn)溶液

5.5.1硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100mg/L，以Se計(jì)）：稱取2.43mg硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（5.4.1），用

水溶解并定容至10mL。0℃～4℃避光保存，有效期3個(gè)月。

5.5.2L-硒代胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100mg/L，以Se計(jì)）：稱取4.15mgL-硒代胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（5.4.2），

用水溶解并定容至10mL。0℃～4℃避光保存，有效期3個(gè)月。

5.5.3Se-甲基硒代-L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100mg/L，以Se計(jì)）：稱取2.26mgSe-甲基硒代-L-半

胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（5.4.3），用水溶解并定容至10mL。0℃～4℃避光保存，有效期3個(gè)月。

5.5.4硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100mg/L，以Se計(jì)）：稱取2.34mg硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（5.4.4），用水溶解并

定容至10mL。0℃～4℃避光保存，有效期3個(gè)月。

5.5.5亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100mg/L，以Se計(jì)）：稱取2.15mg亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（5.4.5），用水溶

解并定容至10mL。0℃～4℃避光保存，有效期3個(gè)月。

5.5.6混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸500μg/L；硒酸鈉100

μg/L；亞硒酸鈉50μg/L）：分別準(zhǔn)確吸取0.5mL硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100mg/L)、L-硒代胱氨酸

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100mg/L)、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100mg/L)；0.1mL硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100

mg/L)、0.05mL亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100mg/L)于100mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度。0℃～4℃

避光保存，有效期2個(gè)月。

5.5.7混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.5.6），用超純水逐級(jí)稀釋配成混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系

列，各物質(zhì)質(zhì)量濃度見(jiàn)表1。依據(jù)樣品中各物質(zhì)質(zhì)量濃度水平，適當(dāng)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)系列中各物質(zhì)質(zhì)量濃度范

圍。

5.5.8甲烷：純度99.999％。

5.5.9液氬：純度99.999％。

表1高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法中各物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列質(zhì)量濃度

標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度（以Se計(jì)）

序號(hào)物質(zhì)名稱單位

系列1系列2系列3系列4系列5

1硒代蛋氨酸μg/L15102550

2L-硒代胱氨酸μg/L15102550

3Se-甲基硒代-L-半胱氨酸μg/L15102550

4硒酸鈉μg/L0.212510

5亞硒酸鈉μg/L0.10.512.55

6儀器和設(shè)備

6.1高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：配碰撞反應(yīng)池。

6.2分析天平：感量為0.1mg和0.01mg。

6.3冷凍組織研磨儀：功耗1000W，頻率60Hz。

6.4恒溫振蕩器：振蕩轉(zhuǎn)速≥300r/min。

6.5超聲波清洗器。

6.6離心機(jī)：轉(zhuǎn)速15000r/min。

6.7渦旋混合器。

6.8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：功耗60W。

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T/GXAS346—2022

7試樣制備

將花生樣品去殼，晾干，放入4℃冷凍研磨儀中粉碎，混勻，裝入潔凈的盛樣容器內(nèi)，密封并標(biāo)明

標(biāo)記，常溫保存。

8分析步驟

8.1試樣提取

稱取試樣0.2g～0.5g(精確至0.0001g)于50mL離心管中，加入80mg鏈霉蛋白酶E和10mL超純水，

渦旋混勻，置于（37±2）℃恒溫振蕩器中（轉(zhuǎn)速300r/min），振蕩酶解4h，取出，于10000r/min離

心10min。吸取5mL上清液，37℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，加超純水定容至1mL后，混勻，過(guò)0.22μm濾膜，待

測(cè)。

8.2測(cè)定

8.2.1液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜參考條件

8.2.1.1液相色譜條件

液相色譜條件設(shè)置如下：

——色譜柱：C8色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），或相當(dāng)者；

——流動(dòng)相：含30mmol/L磷酸二氫鉀、0.15％七氟丁酸、2％甲醇；

——柱溫：30℃；

——流動(dòng)相流速：1.0mL/min；

——進(jìn)樣量：50μL。

8.2.1.2電感耦合等離子體質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件設(shè)置如下：

——霧化器：同心霧化器；

——炬管內(nèi)徑：2.5mm；

——釆樣錐/截取錐(Ni)孔徑：1.0/0.4mm；

——采集質(zhì)量數(shù)：80；

——采集模式：反應(yīng)模式；

——高頻等離子體發(fā)射功率：1300W；

——霧化器流量：0.88L/min；

——載氣流量：0.6mL/min；

——低質(zhì)量截?。?.45；

——蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：35rpm；

——駐留時(shí)間：1000ms。

8.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.5.7），按濃度由低到高依次進(jìn)樣測(cè)定，以各硒形態(tài)色譜峰面積和濃度作圖，

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8.2.3試樣溶液測(cè)定

取試樣溶液（8.1）進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜保留時(shí)間定性，從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣液中硒代

蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒酸鈉、亞硒酸鈉濃度。試樣溶液中5種硒形態(tài)的

響應(yīng)值均應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)；當(dāng)試液超出線性范圍時(shí)，應(yīng)用流動(dòng)相（8.2.1.1）進(jìn)行適當(dāng)稀釋后

進(jìn)樣測(cè)定。硒混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖參見(jiàn)附錄A。

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T/GXAS346—2022

8.3空白試驗(yàn)

除不加試樣外，按8.1和8.2步驟，隨同試樣進(jìn)行空白試驗(yàn)。

9結(jié)果計(jì)算

試樣中硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒酸鈉、亞硒酸鈉的含量（以Se計(jì)）

ωi（mg/kg），按式（1）計(jì)算。

（）××

=·····································································(1)

×

?????????????0????????

式中：????????????1000

——試樣中硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒酸鈉、亞硒酸鈉的含量（以

Se計(jì)），單位為毫克每千克（mg/kg）；

????

????——樣液中硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒酸鈉、亞硒酸鈉的濃度（以

Se計(jì)），單位為微克每升(μg/L）；

????

????——空白試液中硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒酸鈉、亞硒酸鈉的濃

度（以Se計(jì)），單位為微克每升（μg/L）；

0

????——試液定容體積，單位為毫升（mL）；

——試液稀釋倍數(shù)；

????——試樣溶液所代表試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；

????1000——換算系數(shù)。

計(jì)算結(jié)果保留????2位有效數(shù)字。

10精密度

在重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過(guò)算術(shù)平均值的20％。

4

T/GXAS346—2022

附錄A

（資料性）

硒混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖A.1給出了硒混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：

1——亞硒酸鈉；

2——硒酸鈉；

3——L-硒代胱氨酸；

4——Se-甲基硒代-L-半胱氨酸；

5——硒代蛋氨酸。

圖A.1硒混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

5

中華人民共和國(guó)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

花生中硒形態(tài)的測(cè)定高效液相色

譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法

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廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)統(tǒng)一印制

版權(quán)專有侵權(quán)必究

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目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義.........................................................................1

4原理...............................................................................1

5試劑與材料.........................................................................1

6儀器和設(shè)備.........................................................................2

7試樣制備...........................................................................3

8分析步驟...........................................................................3

9結(jié)果計(jì)算...........................................................................4

10精密度............................................................................4

附錄A（資料性）硒混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖.................................................5

I

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由廣西大學(xué)提出、歸口并宣貫。

本文件起草單位：廣西大學(xué)、廣西西大檢測(cè)有限公司、杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院、河南科技大學(xué)、

河南艾格多科技有限公司、蘇州堯智生態(tài)環(huán)保有限公司。

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花生中硒形態(tài)的測(cè)定高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法

1范圍

本文件描述了高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定花生中硒形態(tài)的原理、試劑和材料、儀

器和設(shè)備、試樣制備、分