牛源制品病毒檢測

中國醫(yī)藥生物技術學會(xuéhuì)質量控制專業(yè)委員會動物血清生產與管理學術研討會牛源制品的病毒安全性檢測ViralSafetyDetectiontoBovine-derivedProductsforHumanUses章金剛軍事醫(yī)學(yīxué)科學院輸血醫(yī)學(yīxué)研究所北京1008502004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁問題(wèntí)的提出：瘋牛病與新克-雅氏病艾滋病“生物災害”2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁牛源制品主要是指來源于牛的、與醫(yī)藥有關的藥品(yàopǐn)或生物材料生物技術與藥用材料：血清、膠原、牛黃……生化制品：胸腺肽、小牛血去蛋白提取物

……血漿蛋白：纖維蛋白原、凝血酶、白蛋白、因子Ⅷ……血紅蛋白：血液代用品轉基因蛋白：人白蛋白、人乳鐵蛋白……2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁感染性疾病與關注(guānzhù)對象歐盟對牛血清的要求相關的DNA病毒相關的RNA病毒2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁細菌性疾?。航Y核桿菌病、布魯氏桿菌病、沙門氏菌病、炭疽……病毒性疾病：口蹄疫、傳染性海綿樣腦病、白血病、假性牛痘…...寄生蟲性疾?。喝毡痉煮w(fēntǐ)吸蟲病、弓形體病……牛的感染性疾病(jíbìng)2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁消除(xiāochú)牛源病原體技術2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁值得(zhídé)關注的對象潛在性感染(gǎnrǎn)的病毒：（1）隱性感染而不引起任何疾病的病毒；（2）某些持續(xù)性感染的病毒；（3）處于潛伏狀態(tài)的病毒。由于機體生理狀態(tài)（如懷孕）、外界環(huán)境的變化，機體抵抗力下降等因素，這類病毒可能大量增殖或引起疾病的發(fā)生。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁關注(guānzhù)的對象內源性病毒：內源性反轉錄病毒（ERV）是指以前病毒DNA形式整合進宿主(sùzhǔ)細胞基因組中，并隨細胞染色體復制而復制的反轉錄病毒。朊病毒：朊病毒是亞病毒中的重要感染因子，侵害動物與人類。因其主要由蛋白質構成，迄今尚無含有核酸的確切證據，故暫定名為朊病毒(Virino)或蛋白侵染子(Prion)。由于對各種朊病毒的本質的了解不夠，采用“因子”命名，例如癢疫因子和牛海綿狀腦病因子等，似乎較為恰當。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁病毒(bìngdú)危害性與檢測技術應該考慮生物安全性的病毒集中在兩個方面：人獸共患病(huànbìnɡ)病毒與致癌、免疫抑制或嚴重退行疾病有關的病毒

檢測技術細胞培養(yǎng)：至少2種細胞，其中1種為牛源細胞抗體檢測：BVDV抗體為必檢核酸檢測：PCR、RT-PCR2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁三牛源制品(zhìpǐn)的病毒安全性脊椎動物病毒(bìngdú)的形態(tài)－－DNA病毒2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁脊椎動物病毒(bìngdú)的形態(tài)－－RNA病毒2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁DNA病毒(bìngdú)－－牛乳頭狀瘤病毒牛乳頭狀瘤病毒（bovinepapillomaviruses,BPV）分類地位：乳多空病毒科，乳頭狀瘤病毒屬形態(tài)特征：無囊膜，55nm理化特性(tèxìng)：對酸、堿、有機溶劑有抵抗Amodelofthepapillomaviruscapsid

2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁DNA病毒(bìngdú)－－牛乳頭狀瘤病毒根據交叉雜交試驗，可以感染牛的乳瘤病毒分為6個主要亞群，每一種病毒在牛的皮膚產生特定(tèdìng)的病變。某些亞群可以轉化人細胞，這些病毒與牛的消化道、生殖道和眼部腫瘤等的發(fā)展有關。不能用細胞感染檢測，可用PCR檢測。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁DNA病毒(bìngdú)－－牛多型瘤病毒牛多型瘤病毒（bovinepolyomaviruses,BPyV）分類地位(dìwèi)：乳多空病毒科，多型瘤病毒屬形態(tài)特征：無囊膜，45nm理化特性：對酸、堿、有機溶劑有抵抗PCR檢測，BPyV在胎牛血清中的污染批次達70％，可從某些批次的血清中分離到病毒。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁DNA病毒(bìngdú)－－牛多型瘤病毒BPyV倍受關注，它可能是一種人獸共患病，飼養(yǎng)人員、獸醫(yī)的體內(tǐnèi)有較高水平的抗體，而對大多數人群則缺乏抵抗力?？梢愿腥眷`長類細胞，包括人的細胞。影響細胞培養(yǎng)的結果。檢測：能用細胞感染檢測，在猴腎細胞可以產生特異性的病變，即胞漿、胞核空泡化。PCR檢測，使用特異性的引物擴增、雜交或測序。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁DNA病毒(bìngdú)－－牛腺病毒牛腺病毒（Adenoviruses）分類地位：腺病毒科，哺乳動物腺病毒屬形態(tài)特征(tèzhēng)：無囊膜，90nm理化特性：對酸、堿、有機溶劑有抵抗分2個主要亞群，10個血清型。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁DNA病毒(bìngdú)－－牛腺病毒尚不清楚是否人獸共患，但可以轉化人細胞。能用細胞感染檢測，1群感染牛胚腎細胞并迅速(xùnsù)產生細胞病變，2群感染牛睪丸細胞，有時需要盲傳。也可用PCR檢測。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁DNA病毒(bìngdú)－－牛皰疹病毒牛皰疹病毒（Herpesviruses）：有囊膜，150nm，有4個種。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁DNA病毒(bìngdú)－－牛皰疹病毒BHV-1:引起(yǐnqǐ)牛鼻氣管炎，牛源制品應該檢測病毒。能用細胞感染檢測，也可用PCR檢測。BHV-2:引起牛潰瘍性乳頭炎，奶制品的污染。BHV-3:引起牛惡性卡他熱，具有異源宿主感染性。BHV-5:引起牛腦炎。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁DNA病毒(bìngdú)－－牛痘病毒牛痘病毒（Poxviruses）：有囊膜，300nm，有2個種病毒必須(bìxū)考慮。假牛痘病毒牛丘疹性口炎病毒Orfvirus2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁DNA病毒(bìngdú)－－牛痘病毒假牛痘病毒:引起牛乳房和乳頭增生性病變、擠奶工皮膚丘疹。牛丘疹性口炎病毒引起牛口腔粘膜、鼻鏡、鼻孔上皮潰瘍，人的手、臂丘疹。牛源制品應該檢測(jiǎncè)病毒。能用細胞感染檢測，也可用PCR檢測。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁RNA病毒(bìngdú)－－口蹄疫病毒口蹄疫病毒(bìngdú)（FMDV）：無囊膜，20nm，人獸共患，最重要。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁RNA病毒(bìngdú)－－口蹄疫病毒(bìngdú)口蹄疫病毒(bìngdú)（FMDV）：無囊膜，20nm，人獸共患，最重要。能用細胞感染檢測，也可用PCR檢測。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁RNA病毒(bìngdú)－－牛病毒性腹瀉病毒牛腹瀉病毒（BVDV）：有囊膜，70nm，牛群中普遍存在，倍受關注。能用細胞(xìbāo)感染檢測，也可用PCR檢測。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁RNA病毒(bìngdú)－－牛輪狀病毒牛輪狀病毒：無囊膜，80nm，牛群中普遍存在，對人和牛的危害不大。能用細胞感染(gǎnrǎn)、ELISA等檢測，也可用PCR檢測。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁RNA病毒(bìngdú)－－牛呼腸孤病毒呼腸孤病毒：無囊膜，80nm，牛群中普遍存在，對人和牛的危害不大。能用細胞感染(gǎnrǎn)、ELISA等檢測，也可用PCR檢測。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁RNA病毒(bìngdú)－－牛反轉錄病毒與生物安全性相關的牛反轉錄病毒有兩種牛白血病病毒（BLV）牛免疫(miǎnyì)缺陷病病毒（BIV）2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁RNA病毒(bìngdú)－－牛白血病病毒牛白血病病毒（BLV）：有囊膜，100nm，牛群中普遍存在。未發(fā)現(xiàn)(fāxiàn)對人的感染性，可用PCR檢測。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁RNA病毒(bìngdú)－－牛免疫缺陷病病毒牛免疫缺陷病病毒（BIV）：有囊膜，120nm，國內牛群陽性率2.32％，對人和牛的危害不大。用蛋白印跡(yìnjì)法檢測，也可用PCR檢測。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁朊病毒朊病毒引起(yǐnqǐ)的人和動物的疾病

多種動物和人的亞急性海綿樣腦病與羊癢疫因子有關人的庫魯病(Kuru)、克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、阿耳茨海默病(Alzheimerdisease)、格-史氏綜合征(Gerstmann-Strausslersyndrome)羊的癢疫(Scrapie)，水貂傳染性腦病(Transmissibleminkencephalopathy)，黑尾鹿和糜鹿的慢性消耗病(Chronicwastingdiseaseofmuledeerandelk)，牛海綿狀腦病(Bovinespongiformencephalpopathy)以及某些公園動物的相關(xiāngguān)感染癥。

2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁朊病毒朊病毒引起(yǐnqǐ)的人和動物的疾病

2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁朊病毒朊病毒引起(yǐnqǐ)的人和動物的疾病

2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁五朊病毒朊病毒引起的人和動物(dòngwù)的疾病

2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁朊病毒Prusiner1982:theplaqueproteinistheinfectiousagent(prion)Thenormal,non-infectiousProtein(PrPC)isencodedbythehostandismainlyexpressedonlymphocytesandneuronsTheinfectiousprionprotein(PrPSc)hasthesameaminoacidcomposition,butisresistanttoproteasesandtendstopolymerize2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁朊病毒2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁normalcellinfectedcellPrPCprn-pgenem-RNAnormalproteinm-RNAinfectious

proteinPrPScprn-pgeneEndosomesPlaqueThePrionHypothesis朊病毒2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁veryslowrapidrapidPrPCPrPScPrPCPrPScSeedingmodel(nucleatedcrystallization)Refoldingmodel(templatedirected)朊病毒2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁朊病毒2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁構象依賴性免疫測定方法（conformation-dependentimmunoassay,CDI）能檢出微量的prion蛋白，5h即可出結果。可檢測出8株prion，其中包括分別導致綿羊癢病、鹿的慢性消耗性疾病和瘋牛病的各株prion?？捎糜跈z測活動物。對西班牙、德國和英國的11000頭屠宰牛檢測結果完全與現(xiàn)在應用的方法相符(xiāngfú)，而且在實驗室和田間試驗中，還沒有發(fā)現(xiàn)假陰性或假陽性結果。該方法的另一突出優(yōu)點是自動化，因此可以用于大量動物的篩選。2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁朊病毒WesternBlottingThistypeofassayoffersarapidalternativetothecurrentbio-assayforthedetectionofPrPSCinspikedprocesssamplesfromavalidationstudyandreliesonthedifferentialsensitivityofPrPSCtoproteaseK.TheclosecorrelationbetweenthelevelofPrPscinasampleandinfectivityinthe

bio-assayallowsarapidpreliminaryassessmentofthelevelofinfectivityinspikedsamples.

SamplesaredigestedwithproteaseK,denaturedandthendiluted(viaserial5-folddilutions)toendpoint(thepointwherenoPrPSCcanbedetected)onaSDSPAGEgel.2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁PositiveControlDilutiontoEnd-Point朊病毒2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血(shūxuè)醫(yī)學研究所共五十四頁病毒安全(ānquán)檢測的有關工作血液生物制品與病毒安全檢測研究室：應用發(fā)展研究為主，應用基礎研究為輔；以血液制品及病毒安全性為主線，適當拓展研究領域；積極尋求合作，發(fā)揮集成優(yōu)勢。下設課題組/方向：血漿蛋白的分離純化工藝、特性鑒定、藥理藥效等重組(zhònɡzǔ)蛋白的研究：原核、酵母、哺乳細胞、轉基因動物等抗體制備與應用：單抗、基因重組單抗等配套研究病毒安全檢測：國家生物醫(yī)學分析中心分支血型抗原的相關研究2004年03月軍事醫(yī)學科學院輸血醫(yī)學研究所共五十四頁病毒安全檢測的有關(yǒuguān)工作病毒安全檢測實驗室掛靠在國家生物醫(yī)學分析中心，計劃2004年申請國家認證(rènzhèng)。主要工作包括以下幾個方面：病毒滅活工藝與檢測技術：血漿衍生物、生化制品、相