臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)名詞解釋重要知識(shí)點(diǎn)

抗原抗體反應(yīng)：是指抗原和相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)?？乖贵w間結(jié)合力涉及靜電引力、范德華力、氫鍵和疏水作用力，其中疏水作用力最強(qiáng)，它是在水溶液中兩個(gè)疏水基團(tuán)相互接觸，由于對(duì)水分子排斥而趨向聚集力。親和性（affinity）：是指抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)和一個(gè)相應(yīng)抗原表位（AD）之間結(jié)合強(qiáng)度，取決于兩者空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)程度。親合力（avidity）：是指一個(gè)完整抗體分子抗原結(jié)合部位和若干相應(yīng)抗原表位之間結(jié)合強(qiáng)度，它和親和性、抗體結(jié)合價(jià)、抗原有效AD數(shù)目有關(guān)?？乖贵w反應(yīng)特點(diǎn)：特異性、可逆性、比例性、階段性。帶現(xiàn)象（zonephenomenon）：一種抗原-抗體反應(yīng)現(xiàn)象。在凝集反應(yīng)或沉淀反應(yīng)中，由于抗體過(guò)剩或抗原過(guò)剩，抗原和抗體結(jié)合但不能形成大復(fù)合物，從而不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)反應(yīng)現(xiàn)象。抗體過(guò)量稱為前帶，抗原過(guò)量稱為后帶。免疫原（immunogen）：是指能誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞抗原。免疫佐劑（immunoadjustvant）：簡(jiǎn)稱佐劑，是指某些預(yù)先或和抗原同時(shí)注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型物質(zhì)。半抗原（hapten）：又稱不完全抗原，是指僅具有和抗體結(jié)合能力(抗原性)，而單獨(dú)不能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生（無(wú)免疫原性）物質(zhì)。當(dāng)半抗原和蛋白質(zhì)載體結(jié)合后即可成為完全抗原。載體（carrier）：結(jié)合后能給予半抗原以免疫原性物質(zhì)。載體效應(yīng)：初次免疫和再次免疫時(shí)，只有使半抗原結(jié)合在同一載體上，才能使機(jī)體產(chǎn)生對(duì)半抗原免疫應(yīng)答，該現(xiàn)象稱為~。單克隆抗體（McAB）：將單個(gè)B細(xì)胞分離出來(lái)，加以增殖形成一個(gè)克隆群落，該B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對(duì)單一表位、結(jié)構(gòu)相同、功能均一抗體，即~。多克隆抗體（PcAb）：天然抗原分子中常含多種不同抗原特異性抗原表位，以該抗原物質(zhì)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆被激活，產(chǎn)生含有針對(duì)不同抗原表位免疫球蛋白，即~基因工程抗體（GEAb）：是利用DNA重組及蛋白工程技術(shù)，從基因水平對(duì)編碼抗體基因進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)受體細(xì)胞后重新表達(dá)抗體。雜交瘤技術(shù)【原理】以聚乙二醇（PEG）為細(xì)胞融合劑，使免疫后能產(chǎn)生抗體小鼠脾細(xì)胞和能在體外長(zhǎng)期繁殖小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）選擇性培養(yǎng)基作用，只讓融合成功雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，經(jīng)反復(fù)免疫學(xué)檢測(cè)篩選和單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)（克隆化），最終獲得機(jī)能產(chǎn)生所需單克隆抗體又能長(zhǎng)期體外繁殖雜交瘤細(xì)胞系。將這種細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，可從小鼠腹水中得到高效價(jià)單克隆抗體。（一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞理想骨髓瘤細(xì)胞條件：①細(xì)胞株穩(wěn)定，易于傳代培養(yǎng)；②細(xì)胞株本身不產(chǎn)生免疫球蛋白或細(xì)胞因子；③該細(xì)胞是HGPRT或TK缺陷株；④能和B細(xì)胞融合成穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞；⑤融合率高。目前最常用是NS-1和SP2/O細(xì)胞株（二）免疫脾細(xì)胞多采用和骨髓瘤細(xì)胞同源純系BALB/c小鼠；免疫途徑多為腹腔內(nèi)或皮內(nèi)多點(diǎn)注射法。若抗原微量，可用脾臟內(nèi)直接注射法進(jìn)行免疫。細(xì)胞性抗原不需加佐劑，可溶性抗原需加完全弗氏佐劑。（三）細(xì)胞融合是產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞中心環(huán)節(jié)。一般用分子量1000D、1500D、4000DPEG作細(xì)胞融合劑，濃度30~50%之間，基本方法是將骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞按1:2~1:10比例混合，加入PEG，誘導(dǎo)兩種細(xì)胞融合，時(shí)間控制在2min以內(nèi)，再加入培養(yǎng)液緩慢稀釋PEG融合液，直至失去融合作用，融合細(xì)胞形成具有兩個(gè)或多個(gè)核異核體，最終產(chǎn)生雜交細(xì)胞。（四）雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞合成DNA有兩條途徑：一條為生物合成途徑，可被葉酸拮抗物（氨基蝶呤）阻斷；另一條為替代途徑，葉酸代謝受阻時(shí)，細(xì)胞通過(guò)HGPRT和TK，利用核苷酸前體物合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA。HAT培養(yǎng)液含三種成分：次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選后，只有具備兩親本細(xì)胞雙重特性雜交瘤細(xì)胞能長(zhǎng)期生存并產(chǎn)生抗體，成為制造單克隆抗體細(xì)胞源。細(xì)胞類型正常培養(yǎng)細(xì)胞TK缺陷細(xì)胞HGPRT缺陷細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞正常培養(yǎng)基

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+HAT培養(yǎng)基

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+凝集反應(yīng)（agglutinationreaction）：是指細(xì)菌和紅細(xì)胞或紅細(xì)胞等顆粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗體）顆粒性載體和相應(yīng)抗體（或抗原）特異性結(jié)合后，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)凝集現(xiàn)象。①直接~：在適當(dāng)電解質(zhì)參和下，細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原直接和相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)凝集現(xiàn)象，稱為~。②間接~：可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小顆粒性載體（如正常人O型紅細(xì)胞、細(xì)菌、膠乳顆粒等）表面，然后和相應(yīng)抗體（抗原）作用，在適宜電解質(zhì)存在條件下出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱為~。其敏感度高于直接凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)。正向間接凝集反應(yīng)：用可溶性抗原致敏載體以檢測(cè)標(biāo)本中待檢抗體。反向間接凝集反應(yīng)：用特異性抗體致敏載體以檢測(cè)標(biāo)本中待檢抗原。間接凝集抑制反應(yīng)：用抗原致敏載體顆粒及相應(yīng)抗體作為診斷試劑，檢測(cè)標(biāo)本中是否存在和致敏抗原相同抗原。間接血凝試驗(yàn)：是以紅細(xì)胞為載體間接凝集試驗(yàn)，即用已知抗原（或抗體）致敏紅細(xì)胞，和標(biāo)本中相應(yīng)抗體（或抗原）特異結(jié)合，出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。膠乳凝集抑制試驗(yàn)（LAT）：將抗原（或抗體）致敏膠乳顆粒，直接和待檢標(biāo)本中抗體（或抗原）發(fā)生凝集反應(yīng)。（常用載體顆粒為聚苯乙烯膠乳）直接coombs試驗(yàn)：將抗人球蛋白試劑直接加到表面結(jié)合抗體受檢紅細(xì)胞中，即可見(jiàn)細(xì)胞凝集。用于檢測(cè)吸附于紅細(xì)胞表面不完全抗體。（如HDN、AIHA）間接coombs試驗(yàn)：將受檢血清和具有相應(yīng)抗原性紅細(xì)胞相結(jié)合，再加入抗人球蛋白抗體即可出現(xiàn)可見(jiàn)紅細(xì)胞凝集。用于檢測(cè)血清中游離不完全抗體。沉淀反應(yīng)（precipitationreaction）：是指可溶性抗原和相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)可見(jiàn)沉淀現(xiàn)象。免疫濁度測(cè)定：是應(yīng)用抗原抗體結(jié)合在液體中形成免疫復(fù)合物干擾光線可用儀器檢測(cè)特點(diǎn)，將現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量?jī)x器和自動(dòng)分析檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，對(duì)各種液體介質(zhì)中微量抗原、抗體和藥物及其他小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定技術(shù)。鉤狀效應(yīng)（highdosehookeffect）：免疫濁度測(cè)定，抗原過(guò)量導(dǎo)致形成免疫復(fù)合物（IC）分子小，發(fā)生再解離，濁度下降，光散射減少。單向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)：是先將一定量抗體混于瓊脂凝膠中，使待測(cè)抗原溶液在瓊脂內(nèi)由局部向周圍自由擴(kuò)散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見(jiàn)沉淀環(huán)。環(huán)直徑或面積大小和抗原含量正相關(guān)。常用于IgG/A/M、補(bǔ)體C3/C4等血漿蛋白測(cè)定。雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)：是將抗原核抗體加在同一瓊脂板對(duì)應(yīng)孔中，各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在濃度比例恰當(dāng)處形成沉淀線。①沉淀線靠近抗原孔，說(shuō)明抗體濃度較大；靠近抗體孔則說(shuō)明抗原濃度大。②形成沉淀線彎向分子量大一方。③（待測(cè)物為兩種抗原）兩條沉淀線互相吻合相連，兩抗原中存在相同表位；兩條沉淀線交叉，說(shuō)明兩抗原完全不同；兩條沉淀線相切，提示兩抗原之間有部分相同。對(duì)流免疫電泳（CIEP）：實(shí)質(zhì)上是雙擴(kuò)和電泳結(jié)合。在pH8.6堿性緩沖液瓊脂中進(jìn)行電泳，分子量小、等電點(diǎn)低、帶有較多負(fù)電荷Ag泳向陽(yáng)極，而Ab球蛋白等電點(diǎn)偏高（約為6--7），在pH8.6時(shí)帶負(fù)電荷較少，加上分子量較大，泳動(dòng)慢，受電滲（指電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物相對(duì)移動(dòng)）干擾后向陰極倒退，這樣抗原抗體作相對(duì)運(yùn)動(dòng)，在較短時(shí)間內(nèi)即可相遇，在孔間兩者分子比例合適地方形成沉淀線。（抗原加在-級(jí)，抗體加在+級(jí)）抗原濃度越高，沉淀線越接近抗體孔，甚至超過(guò)抗體孔。本法簡(jiǎn)便快速，靈敏度是雙擴(kuò)8~16倍，可檢出蛋白質(zhì)濃度達(dá)μg/ml，常用于Ag/Ab性質(zhì)/效價(jià)/純度測(cè)定?；鸺庖唠娪荆≧IE）：實(shí)質(zhì)上是單擴(kuò)和電泳結(jié)合。是將抗體混合于瓊脂中，電泳時(shí)，抗體不移動(dòng)，抗原由負(fù)極向正極移動(dòng)，并隨抗原濃度下降，抗原泳動(dòng)基底區(qū)也逐漸變窄，抗原抗體免疫復(fù)合物形成沉淀西安也越來(lái)越窄，形成一個(gè)火箭狀不溶性復(fù)合物沉淀峰?？贵w濃度一定時(shí)，沉淀峰高度和抗原量呈正相關(guān)。其靈敏度可達(dá)ng/ml，常用于IgA/G等蛋白定量。免疫電泳（IEP）：將待測(cè)標(biāo)本（蛋白質(zhì)抗原）置于瓊脂凝膠中電泳，樣品中各蛋白成分因所帶電荷、分子量及構(gòu)型不同，被分成肉眼不可見(jiàn)若干區(qū)帶。然后沿和電泳方向開(kāi)一平行抗體槽并加入抗血清，置室溫或37度使兩者擴(kuò)散。18-24h后，各區(qū)帶蛋白和相應(yīng)Ab在相應(yīng)位置上形成弧形沉淀線。Ag越多，沉淀線越靠近Ab槽，其沉淀線越粗，可做細(xì)微蛋白質(zhì)組分分析，僅為定性實(shí)驗(yàn)。免疫固定電泳（IFE）：實(shí)質(zhì)是區(qū)帶電泳和沉淀反應(yīng)相結(jié)合。先將血清蛋白質(zhì)置于瓊脂凝膠中進(jìn)行區(qū)帶電泳分離，再將固定劑和各型免疫球蛋白及輕鏈抗血清加于凝膠表面泳道上，經(jīng)過(guò)孵育，固定劑和抗血清在凝膠內(nèi)滲透、擴(kuò)散，抗原抗體直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，洗脫游離抗體，形成抗原抗體復(fù)合物則保留在凝膠中。經(jīng)氨基黑，參考泳道和抗原抗體沉淀區(qū)被著色，根據(jù)電泳移動(dòng)距離分離單克隆組分，可對(duì)各類Ig及其輕鏈進(jìn)行分型。最常用于M蛋白鑒定。放射性核素：具有放射性核素，在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性轉(zhuǎn)化變?yōu)榱硪环N（放射性）核素，并同時(shí)釋放射線。這一轉(zhuǎn)變過(guò)程稱為放射性衰變。放射化學(xué)純度：指在標(biāo)記物中結(jié)合在抗原（或抗體）上放射活性占該標(biāo)記物總放射活性百分比。比放射活性：是指單位質(zhì)量標(biāo)記物中所含放射性活度，或每分子抗原（或抗體）平均所結(jié)合放射性原子數(shù)目。放射免疫分析（RIA）：是利用放射性核素標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原（待測(cè)/標(biāo)準(zhǔn)抗原）同時(shí)和限量特異性抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定放射性核素標(biāo)記抗原和抗體復(fù)合物放射性活度，經(jīng)相應(yīng)數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系推算待測(cè)抗原含量。免疫放射分析（IRMA）：是利用放射性標(biāo)記抗體來(lái)測(cè)定樣品中抗原方法，所用標(biāo)記抗體是過(guò)量，抗原全部是非標(biāo)記。待測(cè)抗原和過(guò)量標(biāo)記抗體結(jié)合反應(yīng)形成標(biāo)記抗體-抗原復(fù)合物及游離標(biāo)記抗體，測(cè)定是標(biāo)記抗體-抗原復(fù)合物量.熒光免疫技術(shù)：是將抗原抗體反應(yīng)和熒光技術(shù)相結(jié)合而建立一種免疫熒光技術(shù)，具有高度特異性、敏感性和直觀性。熒光抗體技術(shù)（FAT）：以熒光素標(biāo)記抗體對(duì)抗原進(jìn)行定位染色，并借助熒光顯微鏡觀察標(biāo)本片上熒光染色形態(tài)，從而判斷是否存在待測(cè)抗原，這種技術(shù)就是~。熒光抗體染色方法：直接法（簡(jiǎn)便快速特異性強(qiáng)，但敏感性不如間接法，一種熒光抗體只能檢測(cè)一種抗原）、間接法（敏感性比直接法高5~10倍，一種熒光二抗可檢測(cè)多種抗原/抗體，但容易產(chǎn)生非特異性熒光）、雙標(biāo)記法（用于檢測(cè)同一標(biāo)本中兩種抗原）熒光：熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光能量后，使原來(lái)處于基態(tài)電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，激發(fā)態(tài)電子以發(fā)射光形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱為~。①發(fā)射光譜：是指固定激發(fā)光波長(zhǎng)，在不同波長(zhǎng)下所記錄到樣品發(fā)射熒光譜圖②激發(fā)光譜：是指固定檢測(cè)發(fā)射光（熒光）波長(zhǎng)，用不同波長(zhǎng)激發(fā)光照射樣品得到熒光譜圖。③熒光效率：是指熒光分子將吸收光能轉(zhuǎn)變成熒光百分率，和發(fā)射熒光光量子數(shù)值成正比。④熒光效率＝發(fā)射熒光光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）／吸收光光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）⑤熒光猝滅：熒光分子輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間照射后會(huì)減弱現(xiàn)象。只有那些能產(chǎn)生明顯熒光有機(jī)化合物才能作為熒光色素。stokes位移：即激發(fā)光譜和發(fā)射光譜波長(zhǎng)差。鑭系元素stokes位移大（273nm），激發(fā)/發(fā)射光譜不重疊，可減少干擾。酶免疫技術(shù)：是將酶高效催化反應(yīng)專一性和抗原抗體反應(yīng)特異性相結(jié)合一種免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)。是將酶和抗原或抗體結(jié)合成酶標(biāo)記結(jié)合物（酶標(biāo)抗原/抗體），酶標(biāo)結(jié)合物既保留了抗原/抗體免疫學(xué)活性，同時(shí)也保留了酶對(duì)底物催化活性。在酶標(biāo)記抗體（抗原）和抗原（抗體）特異性反應(yīng)完成后，加入酶作用相應(yīng)底物，通過(guò)酶催化底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量測(cè)定。常用酶：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（ALP）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）常用底物：HRP有鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。ALP為對(duì)-硝基苯磷酸酯（p-NPP）。β-Gal為4-甲基傘形酮-β-D半乳糖苷（4MUG）常用標(biāo)記方法：交聯(lián)法（戊二醛~）和直接法（改良過(guò)碘酸鈉法）固相載體選擇：塑料制品（聚苯乙烯、聚氯乙烯）、微粒、膜載體包被（coating）：將抗體或抗原結(jié)合在固相載體上過(guò)程。封閉（blocking）：用1%~5%牛血清蛋白或5%~20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合位點(diǎn)，消除非特異性吸附干擾。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）【基本原理】把抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面并保持其免疫活性（即形成固相抗原或抗體）；將抗原或抗體和酶連接成酶標(biāo)記抗原或抗體（既保留免疫活性又保留酶活性）；在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟和固相載體表面抗原或抗體起反應(yīng)，用洗滌方法使固相載體上形成抗原抗體復(fù)合物和其它物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上酶量和標(biāo)本中受檢物質(zhì)量有一定比例，加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物量和標(biāo)本中受檢物質(zhì)量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)深淺進(jìn)行定性或定量分析。（一）ELISA檢測(cè)抗原方法主要有：1、雙抗體夾心法：適用于至少兩個(gè)抗原決定簇（AD）Ag。先將特異性抗體和固相載體結(jié)合，形成固相抗體，加入待測(cè)標(biāo)本并溫育，使標(biāo)本中抗原和固相抗體充分反應(yīng)，形成固相抗體抗原復(fù)合物，洗滌去除其他游離成分；然后加入酶標(biāo)記抗體并溫育，使固相抗體抗原復(fù)合物和酶標(biāo)記抗體結(jié)合，形成固相抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，為“雙抗體夾心”；洗滌去除游離酶標(biāo)記抗體。加入底物，固相載體結(jié)合酶可催化底物成為有色產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)物顯色程度進(jìn)行抗原定性或定量檢測(cè)。臨床上常用于乙肝表面抗原HBsAg、甲胎蛋白AFP、人絨毛膜促性腺激素HCG等項(xiàng)目檢測(cè)。2、雙位點(diǎn)一步法：該法是針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同且空間距離較遠(yuǎn)抗原決定簇，分別制備兩種單克隆抗體，在包被時(shí)使用一種單抗，酶標(biāo)記時(shí)使用另一種單抗。測(cè)定時(shí)將含待測(cè)抗原標(biāo)本和酶標(biāo)記抗體同時(shí)加入反應(yīng)體系，兩種抗體分別和不同抗原決定簇結(jié)合，只進(jìn)行一次溫育，在洗滌后即可加底物進(jìn)行顯色反應(yīng)。擔(dān)當(dāng)待測(cè)抗原濃度過(guò)高時(shí)，可出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時(shí)可將標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測(cè)定。）3、競(jìng)爭(zhēng)法：適用于小分子Ag或半抗原（只有一個(gè)AD）。先用特異性抗體包被固相載體，然后同時(shí)加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)記抗原，待測(cè)樣本中抗原和酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)性和固相載體上特異性抗體結(jié)合，溫育一段時(shí)間后洗滌，加入底物顯色。（二）ELISA檢測(cè)抗體方法主要有：1、間接法：檢測(cè)Ab最常用方法。常用酶標(biāo)記羊抗人IgG。2、雙抗原夾心法：靈敏度和特異性高于間接法，原理類似雙抗體夾心法，操作步驟也基本相同，也可采用一步法，但一般不會(huì)出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)。臨床上乙型肝炎表面抗體HBsAb測(cè)定常用此法。3、競(jìng)爭(zhēng)法：當(dāng)相應(yīng)抗原材料中含有難以去除雜質(zhì)，不易得到足夠純化抗原或抗原性質(zhì)不穩(wěn)定時(shí)，可采用此方法。主要用于測(cè)定HBcAb和HBeAb。原理見(jiàn)下：（1）HBcAb競(jìng)爭(zhēng)法：先將核心抗原包被在固相載體上形成固相抗原，，然后加入待測(cè)標(biāo)本和酶標(biāo)記特異性核心抗體，此時(shí)待測(cè)標(biāo)本中HBcAb和酶標(biāo)記HBcAb競(jìng)爭(zhēng)性地和固相載體上核心抗原結(jié)合，溫育后洗滌，加入底物顯色，顯色強(qiáng)弱和待測(cè)標(biāo)本中HBcAb含量負(fù)相關(guān)。（2）HBeAb競(jìng)爭(zhēng)法：先將HBeAb包被在固相載體上形成固相抗體，同時(shí)加入待測(cè)標(biāo)本和中和抗原HBeAg，此時(shí)待測(cè)標(biāo)本中HBeAb和固相抗體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合中和抗原HBeAg，溫育后洗滌，加入酶標(biāo)記HBeAb，酶標(biāo)記抗體和結(jié)合于固相抗體上特異性抗原結(jié)合，溫育后洗滌，加入底物顯色，顯色強(qiáng)弱和待測(cè)標(biāo)本中HBeAb含量呈負(fù)相關(guān)。4、捕獲法：又稱反向間接法，主要用于血清中特定Ig類別測(cè)定，最常用于病原體急性感染診斷中IgM型抗體檢測(cè)。原理：首先將針對(duì)IgM第二抗體包被于固相載體形成固相抗體，加入待測(cè)標(biāo)本后，標(biāo)本中所有IgM（特異/非特異）即可被固相抗體捕獲。第二步加入特異性抗原，其和固相載體上捕獲IgM特異性抗體結(jié)合，再加入針對(duì)特異性抗原酶標(biāo)記抗體，形成固相抗人μ鏈IgM-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，最后加入底物顯色，即可對(duì)待測(cè)標(biāo)本中抗原特異性IgM進(jìn)行定性或定量測(cè)定。此法臨床上常用于病原體急性感染實(shí)驗(yàn)室診斷，如急性甲肝時(shí)可檢測(cè)HAV-IgM抗體，急性乙型肝炎時(shí)可檢測(cè)抗HBc-IgM抗體。發(fā)光免疫分析（CLIA）：是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來(lái)一種檢測(cè)微量抗原或抗體新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。兼有高靈敏性和高特異性。發(fā)光：分子/原子中電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級(jí)）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級(jí)），然后再返回到基態(tài)，并施放光子過(guò)程?；瘜W(xué)發(fā)光：伴隨化學(xué)反應(yīng)過(guò)程所產(chǎn)生光發(fā)射現(xiàn)象。發(fā)光效率：又稱化學(xué)發(fā)光反應(yīng)量子產(chǎn)率，是指發(fā)光劑在反應(yīng)中發(fā)光分子數(shù)和參加反應(yīng)分子數(shù)之比，取決于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子化學(xué)激發(fā)效率和激發(fā)態(tài)分子發(fā)射效率?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)可分為均相反應(yīng)（不需分離）和非均相反應(yīng)（需要分離）非均相分離方式有：固相分離、過(guò)濾分離、珠式分離、順磁性顆粒分離?！净瘜W(xué)發(fā)光劑】直接化學(xué)發(fā)光劑：魯米諾和吖啶酯（常用）間接化學(xué)發(fā)光劑：魯米諾及其衍生物、AMPPD、酞菁/二甲基噻吩衍生物/Eu螯合物【標(biāo)記技術(shù)】常用標(biāo)記方法：碳二亞胺縮合法、過(guò)碘酸鈉氧化法、重氮鹽偶聯(lián)法影響標(biāo)記因素：發(fā)光劑選擇、被標(biāo)記蛋白質(zhì)性質(zhì)、標(biāo)記方法選擇、原料比、標(biāo)記率、溫度、純化和保存?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）【原理】：是用參和催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)酶如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（ALP）來(lái)標(biāo)記抗體（或抗原），和待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)抗原（或抗體）發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后加入底物（發(fā)光劑），酶催化和分解底物發(fā)光。由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物濃度。【特點(diǎn)】：①屬酶免疫測(cè)定范疇，測(cè)定過(guò)程和ELISA類似，僅最后一步酶反應(yīng)底物改為發(fā)光劑、測(cè)定儀器改為光信號(hào)檢測(cè)儀；②酶標(biāo)記抗原或抗體結(jié)合穩(wěn)定；③酶催化魯米諾、AMPPD等發(fā)光劑發(fā)出光穩(wěn)定，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，便于記錄和測(cè)定。電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）【原理】是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體（抗原），以三丙胺（TPA）為電子供體，在電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)（它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程）。在反應(yīng)體系內(nèi)待測(cè)標(biāo)本和相應(yīng)抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，形成磁性微粒包被抗體-待測(cè)抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，復(fù)合物進(jìn)入流動(dòng)室，同時(shí)注入TPA緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被安裝在點(diǎn)擊下面電磁鐵吸引住，而未結(jié)合標(biāo)記抗體和標(biāo)本緩沖液被沖走。和此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光。光信號(hào)由安裝在流動(dòng)室上方光信號(hào)檢測(cè)器檢測(cè)，光強(qiáng)度和待測(cè)抗原濃度成正比?！咎攸c(diǎn)】：①三聯(lián)吡啶釕在電場(chǎng)中因不斷得到三丙胺提供電子，可周而復(fù)始發(fā)光，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，信號(hào)強(qiáng)度高，容易測(cè)定、控制；②三聯(lián)吡啶釕直接標(biāo)記抗原或抗體，結(jié)合穩(wěn)定，不影響標(biāo)記物理化特性；③試劑靈敏度高，穩(wěn)定性好。生物素（B）又稱維生素H，分子式為C10H16O3N2S，等電點(diǎn)（pI）為3.5。生物素結(jié)構(gòu)中，I環(huán)為咪唑酮環(huán)，，是和親合素結(jié)合主要部位；II環(huán)為噻吩環(huán)，含有一個(gè)戊酸側(cè)鏈，末端羧基是標(biāo)記抗體或其他分子唯一結(jié)構(gòu)。抗體分子經(jīng)生物素化后，其結(jié)合抗原活性不受影響。多種酶經(jīng)生物素化后，其催化能力保持不變或稍有降低。生物素-親合素系統(tǒng)【特點(diǎn)】：高特異性、高敏感性、穩(wěn)定強(qiáng)、實(shí)用性強(qiáng)【應(yīng)用】：在標(biāo)記免疫技術(shù)中可應(yīng)用于標(biāo)記信號(hào)放大環(huán)節(jié)，也可用于固相包被（或分離）環(huán)節(jié)一、應(yīng)用于固相載體包被環(huán)節(jié)鏈霉親合素（親合素）為弱酸性蛋白，可以吸附在固相載體（聚苯乙烯微孔板或納米微球）表面，形成鏈霉親合素包被固相載體；利用生物素標(biāo)記抗原（或抗體），使待包被抗原（抗體）通過(guò)生物素和固相材料表面鏈霉親合素結(jié)合，實(shí)現(xiàn)間接包被。此種包被模式不但可增加抗原（或抗體）包被數(shù)量，也可減少空間位阻效應(yīng)，提高抗原（或抗體）利用效率。此外，若固相材料不和生物素化抗原（或抗體）結(jié)合，待生物素化抗原（或抗體）和待檢抗體（或抗原）反應(yīng)后，再加入鏈霉親合素預(yù)包被磁性納米微球，含有生物素免疫復(fù)合物可結(jié)合在固相載體表面，達(dá)到同樣分離效果。二、應(yīng)用于檢測(cè)系統(tǒng)信號(hào)放大生物素-親合素系統(tǒng)用于檢測(cè)信號(hào)放大，可提高標(biāo)記免疫分析敏感性。基本方式有生物素-親合素-生物素模式（BAB）和生物素-親合素模式（BA）或標(biāo)記親合素模式。如將生物素標(biāo)記在第一抗體上稱為直接法，如生物素標(biāo)記在第二抗體上稱為間接法。①生物素-親合素-生物素模式特點(diǎn)是生物素標(biāo)記分子（如生物素標(biāo)記抗體/酶蛋白），以游離親合素為橋，連接抗原-抗體和信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)；由于一個(gè)親合素分子能同時(shí)結(jié)合4個(gè)生物素，且一個(gè)生物素大分子可標(biāo)記多個(gè)生物素而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，提升檢測(cè)敏感性。②實(shí)際應(yīng)用中ABC法：預(yù)先按一定比例將親合素和生物素標(biāo)記示蹤物質(zhì)（如生物素標(biāo)記ALP）混合，形成可溶性親合素-生物素化酶標(biāo)復(fù)合物，同時(shí)確保預(yù)留一定位點(diǎn)和生物素化抗體（或抗原）結(jié)合。此種方法能減少操作步驟，又能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作（有商品化試劑）。將ABC法應(yīng)用于雙抗體夾心ELISA中，形成ABC-ELISA，為常用方法。固相膜免疫分析技術(shù)：是以微孔膜作為固相載體，利用液體可以流過(guò)微孔膜也可以通過(guò)毛細(xì)管作用在膜上向前移行特性，以酶標(biāo)記或各種有色微粒子（如彩色膠乳、膠體金或膠體硒等）標(biāo)記抗體或抗原作為標(biāo)記物，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行抗原或抗體檢測(cè)快速檢驗(yàn)方法。膠體金免疫技術(shù)：是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物或顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)一種標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。膠體金：也稱金溶膠，是金鹽被還原為金原子后形成金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外雙離子層構(gòu)成（內(nèi)層為負(fù)離子層AuCl2-，外層是帶正電荷H+）。由于靜電作用，金顆粒之間相互排斥而懸浮成為一種穩(wěn)定膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電疏水膠溶液，故稱膠體金。免疫金：是指膠體金和抗原或抗體等大分子物質(zhì)結(jié)合物。其制備過(guò)程實(shí)質(zhì)上是抗體蛋白等大分子被吸附到膠體金顆粒表面包被過(guò)程。（一）斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA）【原理】是在以硝酸纖維素膜為載體并包被了抗原或抗體滲濾裝置中，依次滴加標(biāo)本、免疫金及洗滌液，因微孔濾膜貼置于吸水材料上，故溶液流經(jīng)滲濾裝置時(shí)和膜上抗原或抗體快速結(jié)合并起到濃縮作用，達(dá)到快速檢測(cè)目（一般5min左右完成）陽(yáng)性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。本法簡(jiǎn)化了操作步驟，達(dá)到簡(jiǎn)便目，已成為“床旁檢測(cè)（POCT）”主要方法之一?！痉椒愋汀浚孩匐p抗體夾心法：將抗體包被在硝酸纖維素膜中央，滴加待檢標(biāo)本，若標(biāo)本中有待測(cè)抗原則在滲濾過(guò)程中和膜上抗體結(jié)合，然后滴加膠體金標(biāo)記抗體，加洗滌液洗滌后，陽(yáng)性者即在膜中央呈紅色斑點(diǎn)（膠體金聚集）。②間接法：將抗原包被在硝酸纖維素膜上，依次滴加待測(cè)標(biāo)本、洗滌液和膠體金標(biāo)記抗人IgG抗體，再加洗滌液洗滌，陽(yáng)性者即在膜中央呈紅色斑點(diǎn)（膠體金聚集）。本法因受非目IgG干擾，易產(chǎn)生假陽(yáng)性，臨床上較少使用。（二）斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（DICA）【原理】是將膠體金標(biāo)記和蛋白質(zhì)層析技術(shù)相結(jié)合，以硝酸纖維素膜為載體快速固相膜免疫分析技術(shù)。在DICA中，滴加在膜一端標(biāo)本溶液受載體末毛細(xì)管作用向另一端移動(dòng)，猶如層析一般，在移動(dòng)過(guò)程中被分析物和固定于載體膜上某一區(qū)域抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無(wú)關(guān)物則越過(guò)該區(qū)域而被分離，然后通過(guò)膠體金呈色條帶來(lái)判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果?！痉椒愋汀浚弘p抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法（三）臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)1、特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快捷以及操作人員不需技術(shù)培訓(xùn)，無(wú)需特殊儀器設(shè)備，試劑穩(wěn)定、便于保存等特點(diǎn)。2、靈敏度問(wèn)題：靈敏度不及酶標(biāo)法和酶發(fā)光免疫測(cè)定法，臨床應(yīng)用中應(yīng)引起高度重視。3、臨床應(yīng)用：臨床只能作為定性/半定量試驗(yàn)，目前主要應(yīng)用于正常體液中不存在物質(zhì)（如傳染病抗原和抗體以及毒品類藥物）和正常含量極低而在特殊情況下異常升高物質(zhì)（如人絨毛膜促性腺激素HCG）。斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA）【原理】和常規(guī)ELISA相同，不同之處在于斑點(diǎn)-ELISA所用載體為對(duì)蛋白質(zhì)具有極強(qiáng)吸附力（近100%）硝酸纖維素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色沉淀物，使NC染色?！炯夹g(shù)要點(diǎn)】1、抗原包被膜：加少量（1~2μL）抗原于膜上。由于NC膜吸附力強(qiáng)，故需在包被后進(jìn)行封閉。2、抗原抗體反應(yīng)：滴加樣品血清，其中待檢抗體即和NC膜上抗原結(jié)合；洗滌后再滴加酶標(biāo)二抗。3、顯色反應(yīng)：滴加能形成不溶有色沉淀底物溶液（如HRP標(biāo)記物，常用二氨基聯(lián)苯胺）；陽(yáng)性者即可在膜上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)染色斑點(diǎn)?！痉椒ㄔu(píng)價(jià)】斑點(diǎn)-ELISA優(yōu)點(diǎn)為：NC膜吸附蛋白力強(qiáng)，微量抗原吸附完全，故檢出靈敏度可較普通ELISA高6~8倍；試劑用量較ELISA約節(jié)約10倍；操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)及結(jié)果判斷不需特殊設(shè)備條件；吸附抗原（抗體）或已有結(jié)果NC膜可長(zhǎng)期保存（-20℃可長(zhǎng)達(dá)半），不影響其活性。免疫印跡試驗(yàn)（IBT）亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡法（EITB），通常又稱Western-blot?！驹怼渴且环N將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析相結(jié)合技術(shù)，具有分析容量大、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)和分布一種常用方法，如組織抗原定性定量檢測(cè)、多肽分子質(zhì)量測(cè)定及病毒抗體或抗原檢測(cè)等?！炯夹g(shù)要點(diǎn)】1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）：抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶負(fù)電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽(yáng)極涌動(dòng)，分子量越小，涌動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(jiàn)（只有染色后才顯出電泳區(qū)帶）。2、電轉(zhuǎn)移：將在凝膠中已經(jīng)分離條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1~2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離效果肉眼仍不可見(jiàn)。3、酶免疫定位：將印有蛋白質(zhì)條帶硝酸纖維素膜（相當(dāng)于包被了抗原固相載體）依次和特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用HRP底物為3,3-二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）或4-氯-1-萘酚（呈藍(lán)紫色）。陽(yáng)性反應(yīng)條帶清晰可辨。并可根據(jù)SDS時(shí)加入分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分分子量?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】1、抗體性質(zhì)：影響本試驗(yàn)成敗一個(gè)主要因素是抗原分子中可被抗體時(shí)別表位性質(zhì)。只有那些能識(shí)別耐變形表位抗體可和抗原結(jié)合，所以在該試驗(yàn)中常選用多克隆抗體。2、IBT靈敏度：一種是在電泳之前應(yīng)用免疫沉淀法將抗原進(jìn)行純化和濃縮。其他方法都是針對(duì)增強(qiáng)信號(hào)本身設(shè)計(jì)，包括使用信號(hào)更好和更強(qiáng)熒光實(shí)際或使條帶局部酶活性增強(qiáng)等。3、IBT法在臨床應(yīng)用中存在一定局限性。非標(biāo)記抗體酶免疫組織化學(xué)染色首先用酶免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)抗酶抗體，通過(guò)免疫學(xué)反應(yīng)將抗酶抗體和組織抗原聯(lián)系在一起。該方法避免了酶標(biāo)記時(shí)對(duì)抗體損傷，同時(shí)也提高了方法敏感性【技術(shù)類型】（一）酶橋法抗酶抗體作為第三抗體，通過(guò)橋抗體（第二抗體）將特異性識(shí)別組織抗原第一抗體連接，形成酶