放射性配體與受體結合分析實驗方法

放射性配體與受體結合分析實驗方法實驗定義與原理定義放射性配基與受體結合分析簡稱為受體放射分析(radioassayofreceptors),它就是應用放射性核素標記配基與特異受體相結合,研究受體得親與力與受體得數量,以及研究受體亞型得常用方法。原理放射性標記配基(激動劑或拮抗劑)與組織、細胞,或含有受體得制劑一起溫育,使受體與配基充分結合,形成受體-配基復合物,終止反應后,用過濾或離心得方法除去未被結合得標記物,測定濾膜或沉淀物中得放射性,即可計算出與配基結合得受體得量。RBA得分類RBA用放射性核素來標記配基,與相應得受體進行特異性結合反應,可對受體得性質進行定性與定量得分析。

1、定性RBA:就是通過反應得量效關系得變化來判斷受體得類型,單位點或多位點結合式,及受體與配體結合得特點,反應得可逆性、協作性等。

2、定量RBA:就是在已知配體與受體反應性質得基礎上,通過結合反應,給出一定量得組織或細胞中能與該放射性配體結合得受體數及結合得平衡解離常數或結合位點數(最大結合容量)。

實驗材料與儀器實驗材料動物組織(皮層、海馬、紋狀體等)儀器(組織勻漿機、旋渦混合器、低溫高速離心機、電熱恒溫水溫箱、-80℃冰箱、制冰機、抽慮瓶、液閃儀等)材料(2ml/6ml分離管、10ul/200ul/1ml槍頭、微纖維濾紙等)藥品(放射性配基、各種非標計化合物等)實驗儀器組織勻漿機IKA,T10BS25漩渦混合器WH-2低溫高速離心機凱達,TGL20M超低溫冰箱海爾數顯恒溫水浴鍋金燕,HH-S26S制冰機GELIN型號IMS-50automaticiceflakes電熱恒溫水溫箱循環(huán)水式多用真空泵液閃測定計數儀HIDEX,425-034型實驗材料2ml離心管6ml一次性軟試管槍頭1ml10ul200ul大家學習辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜TrisPPO與POPOP過濾裝置砂芯過濾裝置(抽濾瓶)1000mlWhatmanGF/C玻璃微纖維濾紙40mm放射性化合物放射性配體低溫保存實驗方法流程實驗方法流程1、制備受體樣品;2、加樣、溫育進行結合反應;3、終止反應,分離結合物與游離物4、測定結合物得放射性;5、數據處理。實驗具體操作(D1、D2、5-HT)1、配制各種緩沖液及試劑按處方配比配制各種緩沖液貯備液配制各種非標記配體溶液配制各種受試藥物溶液注意:該項操作所需試劑或儀器儀器:分析天平、移液槍、燒杯、量筒、容量瓶、試管、EP管等試劑:無水乙醇、超純水、Tris、抗血酸、優(yōu)降寧、HCl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、DMSO、甲苯、PPO、POPOP、Methysergide、Butaclamol及5HT等2、制備膜受體大鼠斷頭取腦分離出目標組織加10倍體積(V/W)冰冷得緩沖液用組織勻漿機勻漿3次,每次數秒鐘,制成組織勻漿液組織勻漿液用低溫高超離心機離心(12000轉/分)3次,每次20分鐘棄上清液,沉淀(膜受體)放-80度超低溫冰箱保存?zhèn)溆米⒁?該項操作所需試劑或儀器儀器:手術器械、組織勻漿機、制冰機、超低溫冰箱、低溫高超離心機試劑:超純水3、加樣

取出膜受體,加入一定體積得冰冷得緩沖液,混勻,使成一定濃度得膜受體溶液。取放射性配體母液,用無水乙醇稀釋成實驗所需濃度

按以下順序及比例加入各種反應液。(1)總結合管:100ul膜受體+200ul緩沖液+10ul放射性配體(2)非特異管:100ul膜受體+100ul緩沖液+100ul非標記配體+10ul放射性配體(3)受試物管:100ul膜受體+100ul緩沖液+100ul藥物溶液+10ul放射性配體注意:該項操作所需試劑或儀器儀器:移液槍、燒杯、量筒、EP管等試劑:超純水、無水乙醇、放射性配體母液

4、受體配體結合反應

以上各管在加完放射性配體后,立即放入37度得水浴鍋中,孵育20分鐘。20分鐘后把各管放入冰中終止反應。注意:該項操作所需試劑或儀器儀器:恒溫水浴鍋,制冰機試劑:無5、分離游離及結合得放射性配體上述各管在反應結束后,分別倒入抽濾裝置進行過濾,并用5-10ml冰冷得緩沖液沖洗濾膜2次。濾膜放入85度烘箱中烘干,隨后放入測試管中,關加入一定體積得閃爍液,浸泡過夜。注意:該項操作所需試劑或儀器儀器:抽濾器、烘箱、濾紙、移液槍、液閃杯試劑:甲苯、PPO、POPOP6、測定結合型放射配體每分鐘放射計數采用放射性計數儀,測定各測試管中結合型放射配體每分鐘放射計數注意:該項操作所需試劑或儀器儀器:液閃儀試劑:無7、數據處理按以下公式計算各化合物對同位素配基結合得抑制率百分率:抑制率(I%)=(總結合管cpm—化合物cpm)/

(總結合管cpm—非特異結合管cpm)×100%化合物每次實驗做兩復管,進行兩次單獨實驗。8、各種指標IC50:半數抑制濃度KD:平衡解離常數(mol/L),物理意義為受體有一半結合配基時所需要得配基濃度。Bmax:受體最大結合容量(fmol/mg蛋白質)nH:Hill系數Scatchard方程與作圖

(飽與實驗)Scatchard方程與作圖簡單單位點系統受體與配體結合反應(Clark模型)條件:(1)配基與受體結合反應為可逆雙分子反應;(2)所有受體都就是等效與獨立得,同一受體得不同分子對配基得親與力都相等,而且不受鄰近受體分子結合配基與否得影響;(3)配體本身不代謝,也不與其它位置結合;(4)生物效應得強度與濃度近似于總配基濃度。飽與曲線固定得受體數量,固定數量得非標與不同濃度體積得放射性配體

飽與曲線(saturationcurve)1)飽與曲線受體數量一定,當配體(一般就是不同濃度體積得放射性配體與固定數量得非標)得濃度從零開始上升時,形成得復合物也逐漸增多。但由于受體數量有限,又就是可逆反應,因此[RL](受體配體復合物)得增加不就是直線上升,而就是一條上升先快后慢得曲線,最后絕大部分受體與配體結合時,[RL]得增加就非常緩慢,漸趨水平,即受體已經飽與了,此即飽與曲線。#飽與曲線得作用？Scatchard作圖,求得KD與Bmax2)曲線得高度取決于[RT]。在曲線起始段,曲線上升得快慢即曲線得斜率取決于配基與受體得親與力,所以,KD越小(親與力越大),飽與曲線上升越快,KD越大(親與力越小),飽與曲線上升越慢。(即:親與力越大,受體與配件結合速度越快,時間越短)

k1,v1[R]+[L]－－－－[RL]k2,v2KD＝K2/K1=[R][L]/[RL]

飽與曲線得形狀與KD有關(如圖1)。圖1KD對飽與曲線得影響

飽與曲線曲線得高度取決于[RT](如圖2)。

圖2[RT]對飽與曲線影響

質量作用定律(Massactionlaw):受體與配基得結合反應服從可逆反應得質量作用定律,可用下式表示:

k1,v1[R]+[L]－－－－[RL](1)

k2,v2

上式中,[R]與[L]為游離受體與游離配基得濃度,[RL]為復合物濃度,v1與v2為結合速率與解離速率,k1與k2為結合速率常數(associationrateconstant)與解離速率常數(dissociationrateconstant)。

數學表達根據質量作用定律:

v1

=k1[R][L];v2=k2

[RL]當反應達到平衡后,v1=v2,即:k1[R][L]=k2[RL],則平衡解離常數(KD)得數學表達式為:

KD＝K2/K1=[R][L]/[RL](2)

Scatchard作圖

設[LT]為配體得初始濃度,[RT]為受體得初始濃度(即受體總量),則有:

[L]=[LT]–[RL][R]=[RT]–[RL]由式(2)整理可得:

KD＝[RT-RL][L][RL]

將上式整理可得:

[RL]=[RT]

－1_×[RL](Scatchard方程)

[L]KDKD變形:[RL]為受體與配基特異結合得量,換成[B]表示,[L]為自由配基得量,換成[F]表示,[RT]為受體總量,也即受體最大結合量,換成[Bmax]表示,則上式方程變?yōu)?/p>

B/F=Bmax/KD-B/KD([RT]為受體總量,等于[R]與[RL]之與,也就是最大結合量Bmax)以復合物濃度[RL]為橫坐標,以復合物濃度與游離配體得濃度比值[RL]/[L]為縱坐標作圖,即為Scatchard作圖。圖3簡單單位點系統RBA得Scatchard作圖簡單單位點系統Scatchard作圖為一條直線,斜率為-(1/KD),橫軸截距為[RT],縱軸截距為[RT]/KD(見圖3)。由此求得KD與BmaxHill方程與作圖當一個受體分子可以結合一個以上得配基時,配基受體結合反應不就是簡單得雙分子反應,而就是

k1,v1[R]+n[L]－－－－n[RL],根據質量作用定律推導出Hill方程:

k2,v2經過變形得其中n為hill系數,以結合分數B/Bmax對游離配基[L]作圖,得Hill作圖(如右)。(3)將(3)式兩邊取對數

非特異性結合

(non-specificbinding,NSB)

NSB

在RBA系統中,放射性配體除與受體特異性結合外,還可與其她成分(如非特異蛋白、反應容器、分離材料等)結合。NSB得特點

親與力小而結合容量大,不易被飽與,隨反應系統內配體濃度增加而線性增大,而且這種結合與生物效應無關(見圖4)。圖4飽與曲線實驗中TB、SB與NSB得關系在RBA得數據處理時,測得得總結合得放射性(totalbinding,TB),必須減去NSB,才能得到特異性結合(specificbinding,SB)得數據。競爭曲線固定得放射性配基濃度,一定量得受體與不同濃度得未標記化合物數學表達此實驗用于測定非標計藥物與放射性配基競爭結合同一受體得能力。通常用IC50與Ki來表示。閃爍液包括溶劑、閃爍劑與添加劑溶劑:溶解閃爍劑與放射性樣品,吸收與傳遞射線能量。閃爍劑:第一閃爍劑(吸收受激溶劑能量,退激發(fā)光)、第二閃爍劑(波長轉移,匹配光電倍增管光譜;提高淬滅耐受)添加劑:助溶劑、抗淬滅劑各受體得非標與同位素受體非標放射性配基受體組織5-HT1A5-HT(serotonin)3H-8-OH-DPAT大鼠紋狀體/皮層5-HT2AMethysergide3H-Ketanserin大鼠紋狀體/皮層D2Butaclamol3H-Spiperone大鼠紋狀體α1Prazosin3H-prazosin大鼠皮層α2Rauwolscine3H-Rauwolscine大鼠皮層M阿托品3H-QNB(畢茲)大鼠腦去小腦/回腸β心得舒3H-DHA鴨紅細胞/大鼠腦RBA得安全問題β射線放射型物質發(fā)出得射線有三種:天然放射現象三種射線α射線β射線γ射線α射線根據射線得偏轉方向與磁場方向得關系可以確定,偏轉較小得一束由帶正電荷得粒子組成,我們把它叫做α射線,α射線由帶正電得α粒子組成、科學家們研究發(fā)現每個α粒子帶得正電荷就是電子電荷得2倍,α粒子質量大約等于氦原子得質量、進一步研究表明α粒子就就是氦原子核、由于α粒子得質量較大,所以α射線得穿透本領最小,我們用一張厚紙就能把它擋住、β射線與α射線偏轉方向相反得那束射線帶負電荷,我們把它叫做β射線、研究發(fā)現β射線由帶負電得粒子(β粒子)組成、進一步研究表明β粒子就就是電子、

β射線得穿透本領較強,很容易穿透黑紙,還能穿透幾厘米厚得鋁板、γ射線

中間不發(fā)生偏轉得那束射線叫做γ射線,研究表明,γ射線得實質就是一種波長極短得電磁波,它不帶電,就是中性得、

γ射線得穿透本領極強,一般薄金屬板都擋不住它,它能穿透幾十厘米厚得水泥墻與幾厘米厚得鉛板、β射線在某種核反應中,一個中子變成一個電子與一個質子、這就就是原子核內沒有電子,又會放出電子,這就就是產生β射線得原因、β射線就是一種帶負電荷得、高速運行、從核素放射性衰變中釋放出得粒子。人類受到來源于人造或自然界(氚,C－14等)β射線得照射,β射線比α射線更具有穿透力,但在穿過同樣距離,其引起得損傷更小。一些β射線能穿透皮膚,引起放射性傷害。但就是它一旦進入體內引起得危害更大。β粒子能被體外衣服消減、阻擋或一張幾毫米厚得鋁箔完全阻擋。放射防護措施外照防護措施時間防護:盡量減少受照射時間。距離防護:距離越遠,輻射能量越低。屏蔽防護:α射線注意防止內照射;β射線可用鋁、有機玻璃、塑料等原子序數較低得物質;γ射線可用鉛、鐵、混凝土等高原子序數物質。內照射防護措施圍封隔離防擴散:“三區(qū)配置”法,即清潔區(qū)、中間區(qū)、活性區(qū);通風良好、獨立得下水處理系統;遵守SOP。除污保潔防污染個人防護侵入:穿戴適當得個人保護衣具,如工作服、口罩、鞋、帽等。不準在工作場所進食、吸煙。工作結束后進行衛(wèi)生清洗,并作污染檢測。放射性“三廢”處理基本方法:放置衰變、濃縮儲存、稀釋排放固體:一般用放置法(半衰期短)、焚化法(廢氣得處理)、埋藏法(不可燃/焚化殘渣)液體:一般用放置法(半衰期短)、稀釋法(量少濃度低)、濃集法(富集掩埋)氣體:大氣排放(低濃度/氣溶膠)、過濾器或液體吸收(高濃度)表面放射性污染得處理皮膚:輕度,大量清水與肥皂清洗;嚴重,10%EDTA或6、5%高錳酸鉀浸泡清洗工作場所表面:輕度,大量清水或洗滌劑清洗;嚴重,挖去再填充或覆蓋油漆/塑料板工作服:輕度,肥皂水;嚴重,0、02mo