當(dāng)前關(guān)于病原體宏基因組高通量測(cè)序產(chǎn)品的幾點(diǎn)考慮

當(dāng)前關(guān)于病原體宏基因組高通量測(cè)序產(chǎn)品的幾點(diǎn)考慮（原創(chuàng)2022-09-29CMDE中國(guó)器審）感染性疾病是由病原微生物（細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)等）引起的疾病的統(tǒng)稱。據(jù)統(tǒng)計(jì)感染性疾病死因占全部死因的25%以上，是當(dāng)今世界嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的重大疾病。長(zhǎng)期以來(lái)感染性疾病的診斷和療效監(jiān)測(cè)一直依靠形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)以及病原體分離培養(yǎng)等方法，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在感染性疾病的輔助診斷中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)新興的病原體宏基因組高通量測(cè)序（metagenomicnext-generationsequencing，mNGS）技術(shù)，是指采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)特定臨床樣本中所有核酸進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)生物信息學(xué)分析判斷樣本中是否存在病原體的檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)基于分離培養(yǎng)的病原體檢測(cè)技術(shù)相比，該技術(shù)從理論上講能夠無(wú)偏倚的檢測(cè)各類(lèi)微生物（如：病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)等），包括難以培養(yǎng)的病原體以及新發(fā)病原體。mNGS技術(shù)是一個(gè)開(kāi)放的分析和診斷系統(tǒng)，對(duì)于mNGS技術(shù)所檢測(cè)的病原體數(shù)量未有明確規(guī)定，根據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，開(kāi)展相關(guān)檢測(cè)服務(wù)的機(jī)構(gòu)已納入的病原體有近萬(wàn)種，包括細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲(chóng)等，為疑難危重癥及罕見(jiàn)病原體感染的診斷提供了有效的技術(shù)手段。在特定的臨床應(yīng)用場(chǎng)景下，具有臨床意義。針對(duì)mNGS的臨床應(yīng)用，目前已有多個(gè)臨床專家共識(shí)。結(jié)合該技術(shù)的特點(diǎn)，我中心對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的臨床應(yīng)用、設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證確認(rèn)等方面進(jìn)行了專題研究，現(xiàn)將當(dāng)前的幾點(diǎn)考慮總結(jié)如下。一、關(guān)于產(chǎn)品預(yù)期臨床使用場(chǎng)景基于mNGS技術(shù)的產(chǎn)品與常規(guī)的病原體檢測(cè)產(chǎn)品相比，具有檢測(cè)過(guò)程較為復(fù)雜、易受到人源基因的干擾、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、結(jié)果解讀專業(yè)要求高、檢測(cè)成本高等特點(diǎn)，一般用于傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法未能給出明確病原學(xué)結(jié)果從而影響患者準(zhǔn)確診療的感染性疾病、新發(fā)突發(fā)傳染病、危急重癥或排除其他發(fā)熱疾病。推薦臨床通過(guò)擬診先行傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)及常規(guī)分子生物學(xué)產(chǎn)品檢測(cè)常見(jiàn)病原體，不盲目使用mNGS技術(shù)。在必要或緊急情況下，如危急重癥、群體性感染事件等，可考慮與常規(guī)方法同步進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)常規(guī)微生物學(xué)檢查容易明確的病原體不建議進(jìn)行mNGS檢測(cè)。從臨床角度，mNGS結(jié)果不能單獨(dú)作為病原學(xué)確診或排除的證據(jù)。適用場(chǎng)景舉例如下：（一）患者表現(xiàn)為發(fā)熱或發(fā)熱癥候群，病因未明確（符合不明原因發(fā)熱定義），考慮感染或不除外感染，但規(guī)范性經(jīng)驗(yàn)抗感染治療無(wú)效，在應(yīng)用常規(guī)技術(shù)檢測(cè)的基礎(chǔ)上，開(kāi)展mNGS產(chǎn)品檢測(cè)。（二）各種原因?qū)е禄颊呒蔽Ｖ匕Y表現(xiàn)，不除外感染所致，或考慮繼發(fā)或并發(fā)危及生命的嚴(yán)重感染，在常規(guī)檢測(cè)的基礎(chǔ)上，開(kāi)展mNGS產(chǎn)品檢測(cè)。（三）免疫受損患者疑似繼發(fā)感染，常規(guī)病原學(xué)檢查未能明確致病原或/和規(guī)范性經(jīng)驗(yàn)抗感染治療無(wú)效，建議進(jìn)一步完善常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)的同時(shí)，或在其基礎(chǔ)上，開(kāi)展mNGS產(chǎn)品檢測(cè)。（四）疑似局部感染，病原學(xué)診斷未明確、不及時(shí)處理則后果嚴(yán)重時(shí)，在常規(guī)檢測(cè)的基礎(chǔ)上，開(kāi)展mNGS產(chǎn)品檢測(cè)。（五）高度疑似感染性疾病，但病原學(xué)診斷未明確且常規(guī)抗感染治療無(wú)效，建議進(jìn)一步完善常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)、處理原發(fā)感染灶，調(diào)整經(jīng)驗(yàn)抗微生物治療方案的同時(shí)開(kāi)展mNGS檢測(cè)。（六）慢性感染，或慢性疾病不除外感染，尤其是二者臨床表現(xiàn)相似、難以鑒別時(shí)，病情嚴(yán)重或抗感染治療療效不佳需要明確病因，建議在完善常規(guī)檢測(cè)、調(diào)整經(jīng)驗(yàn)治療的同時(shí)開(kāi)展mNGS產(chǎn)品檢測(cè)。（七）其他患者疑似特殊病原體感染或從相關(guān)流行病學(xué)角度考慮需要進(jìn)行mNGS產(chǎn)品檢測(cè)。二、關(guān)于產(chǎn)品的檢測(cè)樣本及適應(yīng)證mNGS產(chǎn)品在目前的臨床應(yīng)用研究中涉及多種適應(yīng)證，如：中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、血流感染、局灶性感染、呼吸道感染、感染性腹瀉等,對(duì)于具有相關(guān)臨床癥狀的病例，應(yīng)在按照現(xiàn)有診療流程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化診療的基礎(chǔ)上開(kāi)展檢測(cè)。針對(duì)患者感染部位不同，采集的樣本類(lèi)型也不同，產(chǎn)品適用的樣本類(lèi)型主要包括：靜脈血、腦脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液、腹水、組織、局灶穿刺物、糞便等多種類(lèi)型。對(duì)于樣本的采集，應(yīng)注意以下兩個(gè)方面，一是，對(duì)于無(wú)菌體液，如靜脈血、腦脊液、胸腔積液、腹水等，需按照嚴(yán)格的無(wú)菌操作采集樣本，采集的樣本須置于無(wú)菌容器內(nèi)；二是，對(duì)于有菌部位的樣本，如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等，應(yīng)標(biāo)明樣本的采集部位，在樣本采集過(guò)程中應(yīng)盡量避免引入該部位的正常菌群，以免干擾后續(xù)檢測(cè)結(jié)果。采集的樣本應(yīng)盡量選取感染部位的體液或組織，可提高檢測(cè)結(jié)果的可信度。若感染部位的樣本采集難度較大，可選擇外周血液樣本，但有可能會(huì)降低檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。產(chǎn)品適用的樣本類(lèi)型推薦優(yōu)先選擇無(wú)菌采集的樣本。關(guān)于不同適應(yīng)證適用的樣本類(lèi)型舉例見(jiàn)表1。表1.產(chǎn)品適應(yīng)證與適用的樣本類(lèi)型舉例三、關(guān)于產(chǎn)品檢測(cè)病原體種類(lèi)范圍mNGS產(chǎn)品檢測(cè)原理為對(duì)臨床樣本中存在的病原體核酸進(jìn)行無(wú)偏倚的檢測(cè)，從產(chǎn)品檢測(cè)的技術(shù)角度考慮，除新發(fā)病原體外，產(chǎn)品的檢測(cè)范圍不應(yīng)局限為某一種或某幾種常見(jiàn)病原微生物，應(yīng)為產(chǎn)品適應(yīng)證、適用樣本中所有可報(bào)告的病原微生物。產(chǎn)品所檢測(cè)的病原微生物受幾個(gè)方面的影響，一是產(chǎn)品配套使用的參考數(shù)據(jù)庫(kù)及生信分析過(guò)程涵蓋的病原體種類(lèi)，如數(shù)據(jù)庫(kù)中未涵蓋某種病原體基因組參考序列，則該類(lèi)病原體不在該產(chǎn)品的檢測(cè)范圍之內(nèi)；二是檢測(cè)樣本類(lèi)型、核酸提取等會(huì)直接影響產(chǎn)品病原體的檢測(cè)種類(lèi)，不同的樣本類(lèi)型可能檢出的病原體會(huì)存在差別，如腦脊液樣本檢出的病原體主要以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原體為主，而糞便樣本檢出病原體主要為消化系統(tǒng)感染的病原體。不同的核酸提取方式對(duì)病原體的檢出種類(lèi)也會(huì)產(chǎn)生影響，如核酸提取過(guò)程未考慮破壁，則產(chǎn)品可能不適用于具有厚細(xì)胞壁的病原體檢測(cè)；三是產(chǎn)品檢測(cè)的目標(biāo)物是否包括不同類(lèi)型的核酸靶標(biāo)，如產(chǎn)品檢測(cè)的靶標(biāo)僅為DNA，則RNA病毒不在該產(chǎn)品的檢測(cè)范圍之內(nèi)。相關(guān)產(chǎn)品的申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品設(shè)計(jì)、適用的樣本類(lèi)型、適應(yīng)證等多個(gè)方面綜合考慮產(chǎn)品預(yù)期用途，確定合理的病原體檢測(cè)范圍。四、關(guān)于產(chǎn)品配套使用的數(shù)據(jù)庫(kù)mNGS產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果，除了產(chǎn)生可用于比對(duì)的微生物短片段序列外，還存在大量人源、環(huán)境微生物、試劑含有的微生物等背景核酸序列，必須依靠生物信息學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行篩選、過(guò)濾、比對(duì)，最終給出微生物物種注釋。結(jié)果分析過(guò)程中，數(shù)據(jù)庫(kù)的使用是必需的，而且是影響mNGS產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。目前相關(guān)產(chǎn)品在選擇配套使用的數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，一般會(huì)存在兩種情況，一種為直接選擇公共數(shù)據(jù)庫(kù)，如：NCBInr/ntdatabase、NCBIRefSeqdatabase等；另一種為自建數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中基因組序列進(jìn)行挑選、整理、分類(lèi)，然后通過(guò)程序軟件將收集到的基因組序列整理成適用于本產(chǎn)品的微生物及人源序列比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)。針對(duì)成熟的產(chǎn)品，建議根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及臨床需要，使用臨床應(yīng)用級(jí)的自建數(shù)據(jù)庫(kù)。在數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建、使用和管理方面應(yīng)注意以下問(wèn)題：（一）需要考慮數(shù)據(jù)庫(kù)的全面性以及納入物種在分類(lèi)學(xué)上的代表性，對(duì)于同一種微生物，往往存在具有遺傳差異的不同亞型或株，所以在選擇基因組時(shí)，應(yīng)考慮到微生物的遺傳多樣性，盡可能選取具有高度代表性的不同亞型或株的高質(zhì)量基因組。（二）無(wú)論所選擇的參考基因組的來(lái)源如何，申請(qǐng)人需要考慮其注釋的準(zhǔn)確性及序列的完整性，防止注釋錯(cuò)誤、命名錯(cuò)誤或者代表性不足臨床相關(guān)微生物列入庫(kù)。（三）申請(qǐng)人應(yīng)在有必要的基礎(chǔ)上，對(duì)納入庫(kù)中的微生物的潛在的臨床意義進(jìn)行注釋，讓結(jié)果解讀人員對(duì)檢測(cè)的微生物有基本的認(rèn)識(shí)和判斷。（四）由于病原體在自然狀態(tài)下是不斷發(fā)生進(jìn)化變異的，致病性也是動(dòng)態(tài)變化的，所以需要及時(shí)（或定期）對(duì)參考數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因組信息及臨床致病證據(jù)進(jìn)行更新。（五）當(dāng)數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)生可能影響病原體判讀結(jié)果的更新后，應(yīng)對(duì)更新后的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證與確認(rèn)。（六）應(yīng)構(gòu)建全面的人源基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)，并評(píng)估最新版國(guó)際人類(lèi)參考基因組和用于構(gòu)建人源基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)所選擇的參考基因組差異，進(jìn)而評(píng)價(jià)人源基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)的代表性，人源基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)用于在生信分析過(guò)程中過(guò)濾人源基因數(shù)據(jù)。（七）mNGS檢測(cè)產(chǎn)品檢測(cè)過(guò)程中一些樣本中會(huì)存在背景菌序列、環(huán)境微生物及實(shí)驗(yàn)室殘留微生物，這些基因序列可造成測(cè)序污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果產(chǎn)生；另外，一些樣本（例如呼吸道樣本）會(huì)存在定植微生物，因此，針對(duì)產(chǎn)品需要構(gòu)建檢測(cè)背景庫(kù)用于過(guò)濾污染序列、區(qū)分背景病原體和致病性病原體。五、關(guān)于測(cè)序數(shù)據(jù)要求人體不同的樣本類(lèi)型單位體積含有的細(xì)胞數(shù)量有巨大的差異，最終的測(cè)序數(shù)據(jù)由微生物序列和人源基因組序列組成，不同的人源細(xì)胞含量、病原微生物感染的類(lèi)型和病原體含量的高低都會(huì)影響測(cè)序數(shù)據(jù)中目標(biāo)微生物序列占比，如組織樣本的人源細(xì)胞含量比較高，測(cè)序所得的序列數(shù)據(jù)中相應(yīng)微生物的占比可能較少，因此，mNGS產(chǎn)品在不同的樣本類(lèi)型中，產(chǎn)品分析靈敏度會(huì)存在差異。該類(lèi)產(chǎn)品可通過(guò)增加測(cè)序數(shù)據(jù)量來(lái)提高待檢出的微生物數(shù)據(jù)量，或通過(guò)富集微生物含量以提升微生物序列的占比，從而提高微生物的檢出率。一般而言，在一定范圍內(nèi)隨著測(cè)序數(shù)據(jù)量的增加，產(chǎn)品的靈敏度會(huì)有所提升。因此，為了保證產(chǎn)品具有滿足臨床要求的靈敏度，針對(duì)某一樣本類(lèi)型，應(yīng)保證一定的測(cè)序數(shù)據(jù)量。產(chǎn)品在設(shè)計(jì)上，一般分為去除宿主人源基因與未去除宿主人源基因兩種設(shè)計(jì)，去除宿主人源基因后，產(chǎn)品產(chǎn)生的相應(yīng)數(shù)據(jù)量會(huì)大大減少。在缺乏有效的人源宿主去除步驟的情況下，單個(gè)樣本檢測(cè)所需的數(shù)據(jù)量應(yīng)充分評(píng)估并設(shè)立合理的指標(biāo)要求。測(cè)序模式一般為單端測(cè)序和雙端測(cè)序，雙端測(cè)序所花費(fèi)的經(jīng)濟(jì)成本及時(shí)間均高于單端測(cè)序，如產(chǎn)品設(shè)計(jì)選擇單端測(cè)序，為確保序列比對(duì)的準(zhǔn)確性，避免因同源錯(cuò)配導(dǎo)致的序列比對(duì)錯(cuò)誤，可參考相關(guān)專家共識(shí)的要求，如測(cè)序序列單端讀長(zhǎng)當(dāng)前建議不少于50bp。為了保證數(shù)據(jù)分析的可靠性，產(chǎn)品檢測(cè)的下機(jī)數(shù)據(jù)應(yīng)有一定的質(zhì)量要求。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)拆分后即得到每個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)，需要進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量過(guò)濾，包括過(guò)濾測(cè)序接頭、低質(zhì)量序列、低復(fù)雜度序列、重復(fù)序列等，將獲得的高質(zhì)量讀長(zhǎng)序列作為微生物鑒定的輸入數(shù)據(jù)。一般而言，數(shù)據(jù)應(yīng)達(dá)到以下指標(biāo)：Q30堿基數(shù)量占比>80%、接頭污染比例不超過(guò)1%、有效序列長(zhǎng)度不小于50bp、數(shù)據(jù)的有效比對(duì)率應(yīng)大于70%等。六、關(guān)于產(chǎn)品陽(yáng)性判斷值的研究產(chǎn)品陽(yáng)性判斷值的研究，主要是為了區(qū)分真陽(yáng)性、真陰性，以及判斷實(shí)驗(yàn)過(guò)程中污染的微生物等?；趍NGS技術(shù)的產(chǎn)品，陽(yáng)性判斷值應(yīng)包含度量標(biāo)準(zhǔn)，例如檢測(cè)結(jié)果中能夠比對(duì)到數(shù)據(jù)庫(kù)中的微生物的序列數(shù)、對(duì)某種微生物的基因組覆蓋度等，可通過(guò)ROC曲線分析的方法對(duì)產(chǎn)品的陽(yáng)性判斷值進(jìn)行研究。在陽(yáng)性判斷值研究過(guò)程中應(yīng)注意，胞內(nèi)菌和厚壁微生物檢出率低，因此即使在檢測(cè)報(bào)告中某種/某些胞內(nèi)菌/厚壁菌檢出序列數(shù)不高，也要考慮其為致病病原體的可能。七、關(guān)于產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告用于臨床輔助診斷的mNGS報(bào)告應(yīng)包括測(cè)序總序列數(shù)、檢測(cè)病原微生物列表、檢出病原特異序列數(shù)量、檢測(cè)病原范圍、覆蓋度、測(cè)序深度、檢測(cè)方法及檢測(cè)技術(shù)說(shuō)明。需要注意的是，檢測(cè)結(jié)果僅代表臨床樣本中檢出或未檢出某微生物的核酸片段，不能明確該物種與感染的關(guān)系，即使陰性結(jié)果也需結(jié)合臨床表現(xiàn)及其他檢查結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。對(duì)于胞內(nèi)菌和厚壁微生物的檢測(cè)，因技術(shù)原因存在一定的偏倚，如對(duì)于胞內(nèi)感染菌因釋放到體液中含量較少而導(dǎo)致檢測(cè)敏感性偏低，對(duì)具有較厚細(xì)胞壁的病原微生物如真菌感染，可能由于核酸提取效率較低，相對(duì)檢出率低，導(dǎo)致臨床檢出率和敏感性較低。因此即使在檢測(cè)結(jié)果中某種胞內(nèi)菌/厚壁菌檢出序列數(shù)不高，也要考慮其為致病病原體的可能。mNGS信息量大，臨床應(yīng)用過(guò)程中，檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)依據(jù)檢測(cè)結(jié)果出具檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)，有些情況下不可能在結(jié)果中列舉出所有檢測(cè)到的病原體，對(duì)于罕見(jiàn)病原體、胞內(nèi)菌等，可能因檢出序列數(shù)少、微生物豐度低，在報(bào)告中未能列舉，如果臨床有疑似特殊病原體的感染，應(yīng)該可以追溯原始數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查詢。八、關(guān)于產(chǎn)品驗(yàn)證與確認(rèn)的考慮基于mNGS技術(shù)的產(chǎn)品，因其預(yù)期用途涵蓋的病原體的種類(lèi)非常廣，產(chǎn)品驗(yàn)證與臨床試驗(yàn)應(yīng)對(duì)檢測(cè)范圍內(nèi)的病原體進(jìn)行有充分覆蓋度、有充分代表性的性能評(píng)價(jià)。產(chǎn)品臨床試驗(yàn)在入組人群上，應(yīng)與產(chǎn)品臨床適用人群一致。在對(duì)比方法選擇上，應(yīng)選擇臨床參考方法作為對(duì)比方法，臨床參考方法應(yīng)綜合病原體分離培養(yǎng)、患者的影像學(xué)檢查結(jié)果、基于宿主反應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果等。同時(shí)，由mNGS獲得致病病原體后，臨床上會(huì)針對(duì)病原體進(jìn)行精準(zhǔn)治療，治療后患者的臨床表現(xiàn)和治療效果的隨訪結(jié)果也可以作為臨床試驗(yàn)對(duì)比方法的證據(jù)。臨床試驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)關(guān)注試驗(yàn)體外診斷試劑對(duì)一些對(duì)于胞內(nèi)感染菌、具有較厚細(xì)胞壁的病原微生物等的臨床性能研究。

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