CSTM-植物油 苯并（a）芘測定 超臨界流體色譜在線凈化-反相高效液相色譜法測定驗證報告

植物油苯并（a）芘測定超臨界流體色譜在線凈化-反相高效液相色譜法驗證報告項目主編單位：島津企業(yè)管理（中國）有限公司參加驗證單位：島津企業(yè)管理（中國）有限公司國家糧食和物資儲備局科學研究院2021年11月16日1.實驗室基本情況表1.參加驗證的人員情況登記表序號姓名專業(yè)職稱或職務從事相關分析工作年限人員1郭彥麗分析化學高級專家15年人員2孫麗鵬分析化學科研員8年人員3黎睿食品科學與工程助理研究員9年人員4滕曉宇食品科學與工程研究實習員2年表2.使用儀器及部件登記表儀器名稱規(guī)格型號出場編號性能狀況(計量/校準狀態(tài)、量程、靈敏度等）備注超臨界流體色譜液相色譜聯(lián)用儀1RF-20AXSL205055022259良好島津設備超臨界流體色譜液相色譜聯(lián)用儀2RF-20AL20495706705良好糧科院設備2實驗部分2.1試劑表3.使用試劑及溶液登記表名稱生產(chǎn)廠家、規(guī)格濃度備注甲醇Fisher,4L,HPLC99.9%乙腈Fisher,4L,HPLC99.9%異丙醇Fisher,4L,HPLC99.9%正己烷Fisher,4L,HPLC99.9%苯并（a）芘甲醇標液中國計量科學研究院,2mL4.9μg/mL標準溶液1苯并（a）芘乙腈標液天津阿爾塔，1mL100μg/mL標準溶液2食用油中苯并芘定量分析質(zhì)控樣品中國檢科院,20g11.53μg/kgPAH42.2儀器條件液相色譜條件：SFC色譜凈化柱：Shim-packUC-XDiol4.6x250mm,5μm；預處理柱：Shim-packVP-ODS4.6x50mm,5μm；分析色譜柱:InertsilODS-P2.1x150mm,5μm；柱溫：40°C；SFC流動相組成：A.超臨界二氧化碳流體；B.甲醇；流動相參考梯度條件見表4。背壓調(diào)節(jié)器（BPR）壓力：15MPa，溫度：50oC。表4.超臨界流體色譜洗脫條件時間/minA超臨界二氧化碳(%)B甲醇（%）流速(mL/min）六通閥位置0.0098231-69.4998231-69.50010011-213.49010011-213.598231-62598231-6分析流動相：乙腈水混合溶液（體積比：9:1），1mL/min；進樣體積：20μL；洗針液：異丙醇；熒光檢測器：激發(fā)波長384nm，發(fā)射波長406nm；3結果和討論3.1專屬性和基質(zhì)效應考察首先，針對植物油中檢出概率高，并且毒性大的四種多環(huán)芳烴：苯并(a)蒽(BaA)、?（Chr）、苯并(b)蒽(BbF)和苯并（a）芘（BaP）在該系統(tǒng)上的分離度進行了考察。這四種化合物也是ECRegulation835/2011中規(guī)定的食用油中須限定多環(huán)芳烴。將BaA、Chr、BbF和BaP四種化合物的混標溶液（各250ppb）注入該系統(tǒng)，在上述條件下（2.2）進行分析，并在四個檢測通道下（通道1：λex=384nm，λem=406nm；通道2：λex=257nm，λem=403nm；通道3：λex=267nm，λem=403nm；通道4：λex=290nm，λem=430nm）進行檢測，結果如圖1所示。其中，BaA出峰時間為14.9min。Chr出峰時間為15.2min，并且在Ex384nm/Em406nm檢測條件下未檢出。BbF出峰時間為16.3min。BaP出峰時間為17.2min。結論：由以上結果，可以看到，在該系統(tǒng)該條件下，通過色譜柱的分離能力和熒光檢測器的選擇性（λex=384nm，λem=406nm，沿用國標），BaP可以和其他三種危害較大的多環(huán)芳烴實現(xiàn)分離，并進行準確定量。BaPBaABaPBaABbFChr圖1BaA、Chr、BbF和BaP混合標液分離色譜圖進一步，在同樣條件下，對苯并（a）芘與其同分異構體苯并（e）芘（BeP）混標溶液（各50ppb）在該系統(tǒng)上的分離情況進行考察。結果圖2所示。BaP和BeP在該實驗條件下能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離，并且，在Ex384nm/Em406nm檢測條件下，50ppb的BeP未能檢出。因此，該色譜條件和熒光檢測條件均能對BaP實現(xiàn)高選擇性的檢出。圖2BaP和BeP混合標液分離色譜圖進一步，對基質(zhì)效應進行考察。按照標準測試程序分別對橄欖油空白基質(zhì)、10μg/kg的苯并（a）芘標準溶液、加標后的橄欖油溶液（10μg/kg加標量）進行測定，色譜峰如圖3所示。不含橄欖油基質(zhì)的標液與橄欖油中的苯并（a）芘測得的峰面積幾乎一致，說明該系統(tǒng)第一維能夠有效去除橄欖油基質(zhì)的干擾，使得在第二維進行苯并（a）芘檢測時，可以得到和標準溶液幾乎相同的響應。以上數(shù)據(jù)說明使用該系統(tǒng)，可以用外標法進行定量。圖3BaP加標橄欖油分析色譜圖3.2線性范圍、檢出限和定量下限該方法標準草案給出了方法的檢出限為0.2mg/kg，定量限為0.5mg/kg，適用范圍為0.5-50mg/kg。依據(jù)美國EPA標準，按照樣品分析的全部步驟由島津企業(yè)管理（北京）有限公司、國家糧食和物資儲備局科學研究院聯(lián)合測試大豆油、花生油、菜籽油三種空白樣品，每種樣品重復測試7次。數(shù)據(jù)如下：表5.方法檢出限試驗原始數(shù)據(jù)平行樣品編號大豆油（μg/kg）花生油（μg/kg）菜籽油（μg/kg）10.460.2100.38820.440.2000.36930.4990.1800.32140.4500.2490.34050.5000.2000.36060.4690.1800.30270.4500.2490.321平均值0.4670.2100.343標準偏差S0.02390.02880.0309統(tǒng)計值t3.143.143.14方法的檢出限LOD0.07490.09060.0971方法定量限LOQ0.2470.2990.320檢出限計算公式：LOD=t（n-1，0.99）×S…………（1）式中：LOD——方法檢出限；n——樣品的平行測定次數(shù)；t——自由度為n-1，置信度為99%時的t分布值（單側），可通過查表獲得。S——n次平行測定的標準偏差。定量限計算公式：LOQ=3.3×LOD……（2）結論：通過對大豆油，花生油和菜籽油三種空白植物油進行考查，驗證了該方法檢出限低于1μg/kg，定量限低于0.4μg/kg。將該方法的檢出限和定量限分別設定為0.2μg/kg和0.5μg/kg符合要求。3.3精密度本標準的精密度試驗是2021年8月-10月由島津企業(yè)管理（中國）有限公司、糧食和物資儲備局科學研究院按不同人員分組，采用不同儀器設備、和不同批次試劑材料對9個植物油樣品按照樣品分析的全部步驟進行測定，每個植物油樣品進行兩次平行測定。組合情況見表5，試驗結果見表6、表7和表8。表6共同試驗組合組別組合要素備注組合1島津設備+試驗人員1+標液1組合2島津設備+試驗人員1+標液2組合3島津設備+試驗人員2+標液1組合4島津設備+試驗人員2+標液2組合5糧科院設備+試驗人員3+標液1組合6糧科院設備+試驗人員3+標液2組合7糧科院設備+試驗人員4+標液1組合8糧科院設備+試驗人員4+標液2表7精密度試驗原始數(shù)據(jù)類別橄欖油0.5ppb橄欖油2.0ppb花生油1ppb花生油10ppb花生油50ppb大豆油2ppb大豆油10ppb菜籽油5ppb菜籽油20ppb組合10.662.011.0810.8551.792.0910.335.1621.030.622.000.8910.9351.132.0710.495.3221.25組合20.642.111.0510.1950.271.9910.405.1321.210.582.020.9510.3550.761.9810.325.2521.21組合30.612.100.9610.1649.881.8410.125.0219.720.582.001.0310.2950.011.939.995.4419.65組合40.622.181.1010.1050.492.1810.355.2820.900.612.081.0210.0050.272.1410.275.3320.84組合50.572.421.1311.7255.852.0011.206.2423.570.632.281.0811.3957.462.1511.485.7223.34組合60.542.091.1510.6352.752.0811.476.7622.120.622.221.079.3652.311.8312.456.5521.54組合70.612.190.9910.6352.052.4210.845.4521.700.842.081.0110.9152.642.1210.735.4121.69組合80.601.991.0010.7950.281.9610.335.1121.970.622.041.0510.6350.761.9610.455.3021.90表8單元平均值數(shù)據(jù)類別橄欖油0.5ppb橄欖油2.0ppb花生油1ppb花生油10ppb花生油50ppb大豆油2ppb大豆油10ppb菜籽油5ppb菜籽油20ppb組合10.642.010.9910.8951.462.0810.415.2421.14組合20.612.061.0010.2750.511.9810.365.1921.21組合30.592.051.0010.2249.951.8910.055.2319.68組合40.622.131.0610.0550.382.1610.315.3020.87組合50.602.351.1011.5556.652.0711.345.9823.46組合60.582.151.1110.0052.531.9511.966.6521.83組合70.722.131.0010.7752.342.2710.785.4321.70組合80.612.011.0310.7150.521.9610.395.2021.94表9單元內(nèi)方差s2類別橄欖油0.5ppb橄欖油2.0ppb花生油1ppb花生油10ppb花生油50ppb大豆油2ppb大豆油10ppb菜籽油5ppb菜籽油20ppb組合11.05E-031.28E-041.86E-023.41E-032.17E-013.12E-041.34E-021.33E-022.24E-02組合21.72E-033.64E-035.43E-031.25E-021.20E-017.23E-052.91E-038.08E-036.55E-06組合34.07E-044.95E-032.00E-038.06E-038.17E-034.13E-038.18E-038.77E-021.97E-03組合41.18E-045.79E-032.97E-035.01E-032.45E-021.17E-033.35E-031.36E-031.89E-03組合51.61E-039.76E-031.20E-035.49E-021.28E+001.03E-024.03E-021.39E-012.59E-02組合63.36E-038.32E-033.16E-037.97E-019.87E-023.17E-024.81E-012.16E-021.72E-01組合72.58E-026.68E-036.12E-053.90E-021.76E-014.76E-025.57E-035.96E-046.53E-05組合81.98E-041.57E-031.49E-031.25E-021.16E-013.20E-077.68E-031.79E-022.48E-03對試驗數(shù)據(jù)進行科克倫、格拉布斯統(tǒng)計檢驗，剔除高度異常值，并計算得到精密度數(shù)據(jù)，具體統(tǒng)計結果見表9和圖4。表.10統(tǒng)計檢驗后保據(jù)留數(shù)情況及精密度數(shù)據(jù)類別橄欖油0.5ppb橄欖油2.0ppb花生油1ppb花生油10ppb花生油50ppb大豆油2ppb大豆油10ppb菜籽油5ppb菜籽油20ppb組合10.662.011.0810.8551.792.0910.335.1621.030.622.000.8910.9351.132.0710.495.3221.25組合20.642.111.0510.1950.271.9910.405.1321.210.582.020.9510.3550.761.9810.325.2521.21組合30.612.100.9610.1649.881.8410.125.0219.720.582.001.0310.2950.011.939.995.4419.65組合40.622.181.1010.1050.492.1810.355.2820.900.612.081.0210.0050.272.1410.275.3320.84組合50.572.421.1311.72-2.0011.20-23.570.632.281.0811.39-2.1511.48-23.34組合60.542.091.15-52.752.0811.47-22.120.622.221.07-52.311.8312.45-21.54組合7-2.190.9910.6352.052.4210.845.4521.70-2.081.0110.9152.642.1210.735.4121.69組合80.601.991.0010.7950.281.9610.335.1121.970.622.041.0510.6350.761.9610.455.3021.90總平均值0.612.111.0410.6451.792.0510.525.2721.48重復性限r(nóng)9.64E-021.97E-011.84E-013.90E-011.42E+003.01E-013.00E-014.09E-014.70E-01再現(xiàn)性限R9.64E-023.41E-011.92E-011.46E+006.19E+004.11E-011.19E+004.09E-013.02E+00圖4重復性限r(nóng)和再現(xiàn)性R擬合曲線2.4正確度選取大豆油、花生油、菜籽油和調(diào)和油四種不同基質(zhì)的植物油，分別精確定量添加苯并(a)芘標準溶液，配置濃度和不確定度見表11。島津企業(yè)管理（北京）有限公司按照樣品分析的全部步驟進行測試。用t檢驗來評定測試結果的正確度，檢驗公式為:測試結果見表12。表.11植物油中苯并（a）芘測試樣品信息基體樣品編號配置濃度（μg/kg）不確定度U（μg/kg）大豆油PA-I4.00.1PA-II15.00.5菜籽油PB0.70.06花生油PC35.01.1調(diào)和油PD45.01.4表.12植物油中苯并（a）芘含量分析結果樣品名稱編號測試結果平均值(μg/kg)標準差s指定值u0(μg/kg)不確定度uCRM正確度Y1(μg/kg)Y2(μg/kg)t0統(tǒng)計值t臨界值大豆油PA-I3.963.863.90.0054.00.11.9956.314大豆油PA-II14.3814.3814.4015.00.52.400菜籽油PB0.870.830.95E-050.70.065.000花生油PC37.6937.6837.75E-0535.01.14.909調(diào)和油PD46.7248.3747.51.3645.01.42.101中國檢科院質(zhì)控樣品103