兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究課件

兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究研究背景

過敏性紫癜(HSP)是兒童時期最常見的以小血管炎癥為主要病變的系統(tǒng)性血管炎，以皮膚紫癜、胃腸道癥狀、關(guān)節(jié)腫痛、腎臟損害為主要臨床表現(xiàn)兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究

HSP發(fā)病率有逐年增多趨勢江西省兒童醫(yī)院每年收治新發(fā)HSP住院人數(shù)研究背景兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究皮疹反復(fù)出現(xiàn)暴發(fā)性、壞死性皮膚紫癜腎臟損傷嚴重的胃腸道大出血新發(fā)病例嚴重腎臟損傷者逐漸增多

紫癜性腎炎占兒童繼發(fā)性腎臟疾病第一位兒童時期終末期腎臟病的主要原因

研究背景兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究

HSP患兒腎臟是否受累及受累程度是決定其預(yù)后的最主要因素

腎臟損傷在過敏性紫癜中的發(fā)生率達30％～50％研究背景兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究病因及發(fā)病機制仍未完全闡明臨床上尚缺乏有效的治療措施加強對過敏性紫癜發(fā)病機制、特別是分子發(fā)病機制的研究以試圖尋找更科學(xué)、更有效的治療方法來控制其進一步發(fā)生與發(fā)展成為廣大兒腎工作者努力的方向研究背景兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究

許多研究者、臨床工作者均在努力尋找能夠減少HSP疾病發(fā)生、導(dǎo)致腎損害的各種因素，以期能指導(dǎo)臨床治療，改善HSP的預(yù)后兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究

目前的研究多集中在單一細胞因子或者單一基因在過敏性紫癜發(fā)病及進展中的作用和關(guān)系上血清中IL-6、TNF-α水平能夠反映HSP患兒的疾病嚴重程度

LinCY,YangYH,LeeCC,etal.Thrombopoietinandinterleukin-6levelsinHenoch-Sch?nleinpurpura[J].JMicrobiolImmunolInfect,2006;39(6):476-82

HSP患兒血清VCAM-1水平與HSP患兒的疾病嚴重程度有關(guān)

傅睿，胡寶金，等.可溶性血管細胞粘附分子1（sVCAM-1）在紫癜性腎炎發(fā)病中的作用探討[J].中國免疫學(xué)雜志，2003；19（2）：129－131.

研究現(xiàn)狀兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究基因多態(tài)性及表達異常與HSP的易感性、腎損傷進展、預(yù)后有相關(guān)性

人類白細胞抗原(HLA)-DQAI、HIA-B35、HLA–DRBI腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)基因細胞毒性T細胞相關(guān)蛋白4基因

家族性地中?；?/p>

C4基因、PAX2

只是從某一方面反映了其中某些單一因素在過敏性紫癜發(fā)病中的作用只是針對一個或幾個基因進行研究，無法達到對基因網(wǎng)絡(luò)化、高通量分析的要求

兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究我科開展的課題血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)在紫癜性腎炎發(fā)病中的作用及其臨床意義的研究巨噬細胞移動抑制因子在紫癜性腎炎發(fā)病中作用及意義巨噬細胞移動抑制因子-173G/C基因多態(tài)性與紫癜性腎炎發(fā)病的關(guān)系足細胞蛋白Podocalyxin在紫癜性腎炎發(fā)病機制中的研究松弛素與兒童過敏性紫癜復(fù)發(fā)及腎損害關(guān)系的研究免疫吸附血液灌流技術(shù)在兒童重癥過敏性紫癜中的臨床應(yīng)用

兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究問題目前研究手段的局限性及單一方面性參與HSP發(fā)生、發(fā)展過程中的主要基因?qū)е翲SP患兒腎損傷的基因

目前并不十分清楚，需要更先進的研究方法兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究基因芯片技術(shù)提供研究平臺

將幾千個基因特異的探針或其cDNA片斷固定在載體上能夠高通量、準確、快速同時進行成千上萬條基因表達的測定

對來源于不同個體、不同組織、不同細胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同病變、不同刺激下的細胞內(nèi)的mRNA或逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進行檢測大規(guī)模對這些基因表達的個體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進行綜合分析和判斷疾病的診斷、鑒別診斷、治療藥物選擇、預(yù)后判斷兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究基因芯片技術(shù)在腎臟疾病診斷和治療中的應(yīng)用兒童腎病綜合征基因表達譜分析系統(tǒng)性紅斑狼瘡Alport綜合征UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的分子機制糖尿病腎病大鼠兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究研究內(nèi)容及目的

利用基因芯片技術(shù)檢測HSP患兒外周血、HSPN患兒腎組織基因表達譜，以正常兒童外周血及正常腎組織基因表達譜為對照，對差異表達基因進行生物信息學(xué)分析，篩選出HSP患兒疾病發(fā)生及腎損傷相關(guān)基因，以探討HSP發(fā)生、發(fā)展的分子機制

兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究研究對象病例組：HSP患兒6例，根據(jù)有無尿改變分為非腎損傷組(NHSPN)3例，腎損傷組(HSPN)3例。對照組：選取年齡、性別與病例組相匹配的3例健康體檢兒童外周血；正常腎組織1例來自腎腫瘤切除術(shù)后遠離腫瘤的正常腎組織。

HSP診斷符合《實用兒科學(xué)》第7版中HSP的診斷標準。HSPN診斷符合中華醫(yī)學(xué)會兒科分會腎臟病學(xué)組制定的診斷標準。

兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究對照組NHSPN組HSPN組外周血或腎組織治療前及病情緩解2周后留取外周血治療前外周血及腎組織外周血及腎組織總RNA抽提及鑒定cDNAmicroarray芯片制備及雜交信號掃描和分析RT-PCR法芯片結(jié)果驗證實驗結(jié)果用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析研究方法及技術(shù)路線兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究

研究結(jié)果與討論總RNA質(zhì)量檢測

芯片數(shù)據(jù)評估

芯片結(jié)果

兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究總RNA質(zhì)量檢測

總RNA經(jīng)生物分光光度計檢測，OD230/OD260/OD280比值均接近1:2:1瓊脂糖凝膠電泳圖均可以清晰地看到5S、18S和28S條帶，亮度28S:18S接近2:1

說明所提取的總RNA完整性好、純度高，質(zhì)量符合表達譜芯片實驗要求兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究芯片數(shù)據(jù)評估

芯片熒光信號掃描圖：芯片信號強度高且均一，基因點清晰，沒有基因點漏點、點重疊以及不正常熒光的情況

兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究

對原始數(shù)據(jù)進行標準化后作Box-Plot圖：所有樣本的信號分布幾乎是相同的，無明顯差異，均可用于進一步數(shù)據(jù)分析

兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究

散點圖：形象化評估兩個比較組間的基因表達差異，X/Y軸是每個樣本的標準化信號值（log2形式），綠色線是折疊變化線，在頂面綠色線以上和底下綠色線以下的基因代表兩個比較組間的差異表達基因兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究

層次分析聚類：將具有相似表達譜的樣品聚集到一類，可以檢測同一類樣本之間重復(fù)性。本研究樣本各組能聚到一類,說明同一類樣本間的重復(fù)性良好兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究芯片結(jié)果

組間差異表達基因篩選標準：火山圖（VolcanoPlots）：兩條垂直線代表上下調(diào)1.5倍，水平線代表T檢驗P值＜0.05，圖中紅點代表具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表達基因兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究單純過敏性紫癜組與對照組間共有1064條差異表達基因，其中上調(diào)基因661條，下調(diào)基因403條，Pathway分析共有21條通路發(fā)生顯著性異常改變兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究單純過敏性紫癜組與對照組部分上調(diào)差異表達基因GENE-IDGENE-NAME

基因描述GO生物過程51286BM88BM88抗原無注釋7077TIMP2組織金屬蛋白酶抑制劑2細胞增殖64129TINAGL1小管間質(zhì)性腎炎抗原樣1炎癥/免疫114904C1QTNF6補體C1Q腫瘤壞死蛋白6無注釋30835CD209CD209分子炎癥/免疫163702IL28RA白細胞介素28受體α（??干擾素λ受體）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)炎癥/免疫5228PGF胎盤生長因子，血管內(nèi)皮生長因子相關(guān)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)4485MST1巨噬細胞刺激1（類肝細胞生長因子）蛋白水解兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究

單純過敏性紫癜組與對照組部分下調(diào)差異表達基因GENE-IDNAME

基因描述GO生物過程3428IFI16干擾素γ誘導(dǎo)蛋白16炎癥/免疫、細胞增殖/分化、轉(zhuǎn)錄25816TNFAIP8腫瘤壞死因子，α-誘導(dǎo)蛋白8凋亡的調(diào)控9516LITAF脂多糖誘導(dǎo)腫瘤壞死因子凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控8743TNFSF10腫瘤壞死因子（配體）超家族成員10凋亡、免疫、信號傳導(dǎo)3002GZMB

顆粒酶B（顆粒酶2，細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)絲氨酸酯酶1）蛋白水解、細胞凋亡/溶解313AOAHacyloxyacyl水解酶（中性粒細胞）炎癥/免疫、代謝5993RFX5調(diào)控因子X，5（影響人類白細胞抗原II類的表達）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)10588MTHFS5,10甲酰四氫葉酸合成酶（5-甲酰四氫葉酸環(huán)連接酶）代謝兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究上調(diào)基因（661條）較下調(diào)基因（403條）多，HSP差異基因上調(diào)為主涉及目前在HSP發(fā)生發(fā)展中已被認識的基因如：粘附分子類（BCAM、CEACAM1、CEACAM3、GLYCAM1）、補體及細胞因子（C1QC、C1QTNF6、C1QTNF8、CCL21、CD5L、CD209、IL28RA、IL31RA、IL5RA、MST1、TNFRSF6B、HIF3A）、血類管緊張素Ⅱ受體1（AGTRL1）等涉及一些未被認識的可能參與HSP發(fā)生過程的基因如：抗原（BM88）、防御β126(DEFB126)、顆粒酶B(GZMB)、AOAH、調(diào)控因子（RFX5）等

單純過敏性紫癜組與對照組間差異表達基因兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究紫癜性腎炎組與單純過敏性紫癜組間共有830條差異表達基因，其中上調(diào)基因385條，下調(diào)基因445條，Pathway分析共有49條通路發(fā)生顯著性異常改變兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究紫癜性腎炎與單純過敏性紫癜組部分上調(diào)差異表達基因GENE-IDNAME

基因描述GO生物過程1879EBF早期B細胞因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控9242ABF1/MSC激活的B細胞因子1轉(zhuǎn)錄調(diào)控3108HLA-DMA主要組織相容性復(fù)合體II類DMα炎癥/免疫3123HLA-DRB1主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類DRβ1炎癥/免疫7423VEGFB血管內(nèi)皮生長因子β

細胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)7048TGFBR2

轉(zhuǎn)化生長因子β受體II（70/80kDa）信號通路、細胞增殖6648SOD2超氧化物歧化酶2氧化應(yīng)激、代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控7127TNFAIP2腫瘤壞死因子α-誘導(dǎo)蛋白2血管發(fā)生、細胞分化兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究紫癜性腎炎與單純過敏性紫癜組部分下調(diào)差異表達基因GENE-IDNAME基因描述GO生物過程2161F12凝血因子XII血液凝固、纖溶3336HSPE1熱休克10KD蛋白1蛋白質(zhì)折疊3324HSP90AA2熱休克蛋白90kDaα（胞質(zhì)），A類成員2無注釋3070HELLS解旋酶，淋巴特定轉(zhuǎn)錄、有絲分裂2887GRB10生長因子受體10細胞內(nèi)的信號級聯(lián)、胰島素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路3609ILF3白細胞介素增強子結(jié)合因子3轉(zhuǎn)錄、調(diào)控2574GAGE2G抗原2無注釋2576GAGE4G抗原4無注釋兒童過敏性紫癜相關(guān)基因表達譜研究紫癜性腎炎組與單純過敏性紫癜組間差異表達基因上調(diào)（385條）較下調(diào)（445條)少其中凝血因子12（F12）、熱休克10KD蛋白1（HSPE1）、HSP90AA2、MTHFS、G抗原2/4/6(GAGE2/4/6)、生長因子受體10（GRB10）、白細胞介素增強子結(jié)合因子3（ILF3）等基因上調(diào)倍數(shù)大于2.5倍HLA-DMA/DRB1、早期B細胞因子（EBF）、SOD2、TGFBR2、激活的B細胞因子1（ABF1）、干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白16（