神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化的研究

神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化的研究【摘要】目的觀察神經(jīng)生長因子對神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)細(xì)胞增殖的抑制和可能的分子機(jī)制及NGF-TrkA信號傳導(dǎo)途徑在NB細(xì)胞分化中的作用。方法取本院住院患兒新鮮手術(shù)標(biāo)本，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)作為細(xì)胞模型，通過臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)活細(xì)胞；觀察NGF干預(yù)前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；MTT法檢測細(xì)胞的增值活性；RT-PCR分析TrkA表達(dá)情況。結(jié)果NGF作用NB細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，并可劑量依賴性的抑制細(xì)胞增殖，2d時TrkA表達(dá)增加，4d以后出現(xiàn)TrkA表達(dá)的明顯增加。結(jié)論NGF對NB細(xì)胞體外增殖有抑制作用并誘導(dǎo)其分化，且表現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；NGF可誘導(dǎo)NB細(xì)胞分化成熟及TrkAmRNA表達(dá)水平增高，可能是NGF誘導(dǎo)NB細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)的分子生物學(xué)機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)母細(xì)胞瘤神經(jīng)生長因子細(xì)胞分化

【Abstract】ObjectiveToinvestigatethedifferentiationandproliferationofneuroblastoma(NB)cellsinducedbynervegrowthfactor(NGF)anditspossiblemechanisms.MethodsNBtumortissueswerecollectedandprimarycellculturewasperformed.Trypanblueexclusionwasusedtocountthealivecells.Morphologicalchangeswereobservedunderthephase-contrastmicroscope.ThechangeofcellproliferationwasdeterminedbymeansofMTTassay.TrkAexpressionwasexaminedbyRT-PCRmethod.ResultsByday,thealivecellsofgroupA、BandCdecreasedbytreatmentofNGF;morphologicalchangesofNBcellswerealsoobserved.RT-PCRdetectionshowedthattheTrkAmRNAexpressionincreasedfromdayandreacheditspeakondayinatimeanddosedependentmannerbytreatmentofNGF.ConclusionNBcellstreatedbyNGFdifferentiatetoneuron-likecellsandthecellgrowthisinhibitedinadose-dependentmanner.TrkA'sexpressionisincreasedbyNGF.ThismaybeoneofthemechanismsofspontaneousregressionofNB.

【Keywords】neuroblastomanervegrowthfactorcelldifferentiation

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)是起源于胚胎期神經(jīng)嵴細(xì)胞的兒童惡性腫瘤，自然退化常見于新生兒、嬰兒和早期腫瘤，而較大兒童晚期患者惡性程度高，預(yù)后差。對化療耐藥是治療失敗的主要原因［1］。如何應(yīng)用人為方法使NB細(xì)胞分化、逆轉(zhuǎn)、消退，是當(dāng)今腫瘤界研究的熱點(diǎn)問題［2］，用藥物誘導(dǎo)NB向良性轉(zhuǎn)化可能成為臨床治療的一個新途徑。

1資料與方法

一般資料

歲男性患兒，因發(fā)現(xiàn)“腹部腫物”1周，于XX年6月10日入住本院，行腹部B超、CT檢查，考慮為神經(jīng)源性腫瘤；于XX年6月12日行剖腹探查、腹部腫物切除術(shù)。手術(shù)標(biāo)本冰凍切片提示神經(jīng)母細(xì)胞瘤。為Evans分期Ⅲ期，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，術(shù)后病理診斷：神經(jīng)母細(xì)胞瘤。

研究方法

(1)試劑：NGF購自晶美公司；MTT購自華美公司。其它均為國產(chǎn)分析純試劑。Trizol購自美國GBICO公司；RT-PCR試劑盒購自Promega公司；TaqDNA合成酶、瓊脂粉購自上海生工生物工程公司；DNAMarker購自寶生物工程大連公司；引物TrkA引物序列根據(jù)Genebank資料設(shè)計如下：TrkAsense:CTGGGCGGAGTGCCTGAA，antisense：GGCTC-CGGCTCCAGGAA，擴(kuò)增產(chǎn)物為528bp，TrkA引物及β-actin(114bp)內(nèi)參照引物由北京賽百盛公司合成。(2)NB細(xì)胞培養(yǎng)：用消化法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM，含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素/ml，在5%CO2、95%空氣環(huán)境中恒溫恒濕孵育。(3)實驗分組：用作生長及分化研究的NB細(xì)胞分成4組。A組：DMEM培養(yǎng)基加入NGF使終濃度為5μmol/L；B組：DMEM培養(yǎng)基加入NGF使終濃度為10μmol/L；C組：DMEM培養(yǎng)基加入NGF使終濃度為20μmol/L；D組：作為對照組，培養(yǎng)基中不加NGF干預(yù)。每組設(shè)4份同樣的標(biāo)本。(4)活細(xì)胞計數(shù)：取指數(shù)生長期細(xì)胞，接種至24孔培養(yǎng)板,細(xì)胞濃度為1×105細(xì)胞/ml，于0、2、4、6、8d用臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)活細(xì)胞。(5)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：用作分化研究的細(xì)胞，以1×103/ml密度接種至25ml培養(yǎng)瓶中，A、B、C、D組同時接種，于0、2、4、6、8d在相差顯微鏡下計數(shù)分化細(xì)胞。方法：對每瓶細(xì)胞選取5個不同視野的200個細(xì)胞，根據(jù)Sandquist法，有一個或一個以上的軸突長度延伸至胞體直徑二倍以上者為細(xì)胞分化，計算細(xì)胞分化百分率。(6)MTT法檢測NB細(xì)胞增殖活性原理：活細(xì)胞，特別是增殖的細(xì)胞中，其中線粒體能量代謝中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的四甲基偶氮唑鹽(MTT)還原成藍(lán)紫色的結(jié)晶沉積在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍，形成的結(jié)晶與細(xì)胞數(shù)成正比，用酸化異丙醇溶解結(jié)晶即可在酶標(biāo)比色計上直接比色，此數(shù)值的升高標(biāo)志細(xì)胞能量代謝旺盛、增殖活躍。檢測方法：細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h使細(xì)胞貼壁，按A、B、C、D組要求加入NGF，繼續(xù)培養(yǎng)2h；吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞一次；每孔加濃度5mg/ml的MTT染液20μl(溶于PBS中，濾過除菌，4℃避光保存)于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育細(xì)胞4～h；加入新鮮配制的DMSO溶解MTT150μl/孔，水平搖床上搖10min，使還原產(chǎn)物充分溶解，酶標(biāo)儀上570nm波長下測定光密度值。(7)TrkA表達(dá)檢測：①NB細(xì)胞總RNA的提?。簩⑴囵B(yǎng)的細(xì)胞用Trizol提取總RNA，紫外分光光度計測吸光度OD260值和OD280值，計算提取物濃度及純度。經(jīng)定量后用DEPC水稀釋至1mg/ml，-20℃保存。②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA。③PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：反應(yīng)體系為25μl，PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，變性1min，55℃退火45s，72℃延伸2min，共35個循環(huán)。④擴(kuò)增產(chǎn)物半定量分析：取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠(μg/ml)的2%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外透射儀觀察RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與Marker比較鑒定結(jié)果，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描擴(kuò)增帶，用TrkA/β-actin比值表示TrkA的相對表達(dá)水平。

統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，兩均數(shù)比較采用校正t檢驗。

2結(jié)果

.1NGF對NB細(xì)胞活細(xì)胞計數(shù)的影響見表1。表1不同作用時間的活細(xì)胞計數(shù)比較注：*Ｐ.2NGF誘導(dǎo)NB細(xì)胞分化觀察

NB細(xì)胞呈小梭形，部分呈淚滴狀，少數(shù)呈三角形。經(jīng)NGF干預(yù)后，2d后開始出現(xiàn)形態(tài)分化，細(xì)胞變短、變圓，逐漸有神經(jīng)突起形成，類似樹突、軸突，整個細(xì)胞形態(tài)由原來的小梭形變?yōu)轭惗噙呅?，類似成熟的神?jīng)節(jié)細(xì)胞。不同作用時間、不同濃度NGF干預(yù)的細(xì)胞分化百分率見表2。表2不同作用時間、不同濃度NGF對NB細(xì)胞分化百分率的影響注：*P.3NGF對NB細(xì)胞增殖的抑制見表3。MTT檢測結(jié)果顯示NGF劑量依賴性的抑制NB細(xì)胞的增殖。表3NGF抑制NB細(xì)胞增殖注：A、B、C三組與D組相比P.4不同濃度NGF對TrkAmRNA/βactin比值的影響見表4。NGF不同濃度誘導(dǎo)后，隨著作用時間和濃度的增長，TrkAmRNA表達(dá)均增強(qiáng)，與作用時間和NGF濃度正相關(guān)。表4不同濃度NGF對TrkAmRNA/β-actin比值的影響

3討論

NB是小兒最常見的實體瘤之一，起源于原始神經(jīng)嵴［3］，惡性度極高，早期易發(fā)生肝和皮膚轉(zhuǎn)移，50％以上發(fā)生骨髓轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，但部分患者具有自行消退和體外誘導(dǎo)分化成熟的特點(diǎn)，有研究認(rèn)為細(xì)胞周期G1期“限制點(diǎn)”的Rb通路蛋白表達(dá)參與了神經(jīng)母細(xì)胞瘤向良性的轉(zhuǎn)化［4］。探討誘導(dǎo)瘤細(xì)胞分化成熟的因素具有至關(guān)重要的意義。

神經(jīng)生長因子是最早發(fā)現(xiàn)的生長因子，β亞基是NGF的活性部分，稱為β-NGF，也可稱其為神經(jīng)生長因子，它是一種較強(qiáng)的促細(xì)胞分裂因子，作用廣泛，效應(yīng)細(xì)胞多，在神經(jīng)元的存活、生長、發(fā)育和分化及損傷修復(fù)與再生等方面具有重要的作用，有研究證實在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)入NGF基因，具有誘導(dǎo)其分化的作用［5］。本結(jié)果顯示NGF本身對培養(yǎng)的瘤細(xì)胞也具有誘導(dǎo)分化、抑制增殖和刺激TrkA受體表達(dá)的功能。一般認(rèn)為，NGF通過與受體結(jié)合而產(chǎn)生促進(jìn)NB細(xì)胞分化的作用，主要通過高親和力受體TrkA介導(dǎo)，缺乏TrkA受體或其結(jié)構(gòu)異常是神經(jīng)母細(xì)胞瘤產(chǎn)生和不分化的重要原因［6］。本研究中NGF時間和劑量依賴性的促進(jìn)TrkAmRNA表達(dá)，并使分化細(xì)胞的百分比顯著升高，證實其具有通過誘導(dǎo)TrkA高表達(dá)而引起NB細(xì)胞分化的功能。TrkA主要由一種跨膜酪氨酸激酶gp140trk組成，它是原癌基因Trk的產(chǎn)物。當(dāng)NGF與TrkA結(jié)合后，通過RAS/MAPK信號通路的激活，影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，表現(xiàn)為對細(xì)胞生長的調(diào)控［7］。本研究中NGF使活細(xì)胞數(shù)減少，劑量依賴性的抑制細(xì)胞增殖。NGF與TrkA間的相互作用是影響惡性腫瘤細(xì)胞生長和擴(kuò)展、播散的重要因素，TrkA與其配體NGF結(jié)合引發(fā)信號傳導(dǎo)的瀑布式級鏈反應(yīng)。本研究證實NGF可在體外誘導(dǎo)NB瘤細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，在NB患兒向成熟方向分化過程中起到重要作用。近年來的研究表明，TrkA所介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路在NGF誘導(dǎo)包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤在內(nèi)的多種神經(jīng)源性體外培養(yǎng)細(xì)胞分化過程中起到較為決定性的作用［8］

RAS/MAPK信號通路的激活，對于NGF介導(dǎo)的NB細(xì)胞的分化來說，可能是最重要的。與凋亡有關(guān)的基因c-myc與神經(jīng)生長因子共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，NGF能選擇性誘導(dǎo)NB細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化的瘤細(xì)胞中c-myc表達(dá)下降，提示NGF可能還通過抑制c-myc表達(dá)而促進(jìn)分化。從惡性腫瘤細(xì)胞向成熟分化逆轉(zhuǎn)這個角度出發(fā)，本研究結(jié)果具有重要的意義，可作為對該腫瘤進(jìn)行實驗性基因治療的重要指標(biāo)。

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