TCIRA 56-2023 輻照滅活高致病性病毒劑量的確定方法

中國同位素與輻射行業(yè)協(xié)會IT/CIRA56—2023前言 Ⅲ1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 1 25材料與設(shè)備 26指示病毒預(yù)試驗 27高致病性病毒輻照滅活試驗 38病毒滅活有效性與最低有效輻照滅活劑量判定 3附錄A(規(guī)范性)輻照設(shè)備劑量標(biāo)定方法 4 7Ⅲ1T/CIRA56—2023輻照滅活高致病性病毒劑量的確定方法本文件規(guī)定了輻照滅活高致病性病毒劑量的確定方法，包括材料與設(shè)備、指示病毒預(yù)試驗、高致病性病毒輻照滅活試驗、病毒滅活有效性與最低有效輻照滅活劑量判定等要求。本文件適用于在BSL3、BSL4實驗室中使用電子束輻照滅活高致病性病毒劑量的確定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB18871電離輻射防護(hù)與輻射源安全基本標(biāo)準(zhǔn)WS/T367—2012醫(yī)療機(jī)構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范WS/T775—2021新型冠狀病毒消毒效果實驗室評價標(biāo)準(zhǔn)病原微生物實驗室生物安全管理條例中華人民共和國國務(wù)院424號令3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。高致病性病毒highlypathogenicvirus能夠引起人類或者動物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動物與人、動物與動物間傳播的病毒。病毒滅活virusinactivation通過物理或化學(xué)方法使病毒失去感染性。吸收劑量absorbeddose電離輻射授予質(zhì)量為dm的物質(zhì)的平均能量de除以物質(zhì)質(zhì)量dm的商。最低有效滅活劑量minimumeffectivedose為達(dá)到滅活病毒目的所需要的最低吸收劑量，即工藝劑量下限值。病毒滴度virustiter單位體積液體中具有感染能力病毒的數(shù)目。2半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量50%tissuecultureinfectivedose能在50%細(xì)胞培養(yǎng)板孔引起細(xì)胞病變(cytopathiceffect,CPE)的病毒量，是病毒滴度常用的測量在病毒去除和滅活工藝驗證研究中使用的用于顯示工藝處理效果的感染性活病毒。4原理失去感染性。用細(xì)胞感染法測定輻照處理前后樣本中病毒滅活效果，以細(xì)胞病變作為判斷指標(biāo)；輻照處理使病毒滴度對數(shù)值不低于4的樣品失去感染性，判斷為有效滅活。使病毒滴度值等于4的樣品失5材料與設(shè)備應(yīng)滿足以下條件：b)單次輻照劑量0～150kGy;c)加速器能放置于BSL3、BSL4實驗室內(nèi)。需滿足以下條件：c)輻照設(shè)備使用前應(yīng)進(jìn)行劑量率標(biāo)定，具體按照附錄A執(zhí)行。6指示病毒預(yù)試驗需滿足以下條件：a)所選指示病毒應(yīng)和擬開展試驗的高致病性病毒屬于同一種屬；b)所選指示病毒應(yīng)屬于低致病性或宿主為非靈長類的病毒，可在低安全等級實驗室開展相關(guān)3對指示病毒采取的輻照滅活試驗方法、條件、操作步驟和判定標(biāo)準(zhǔn)等應(yīng)與擬開展試驗的高致病性病毒一致。a)先對高致病性病毒樣品進(jìn)行滴度測定，試驗病毒滴度對數(shù)值應(yīng)≥4.0;b)通過調(diào)整上樣量和稀釋，使至少一次試驗的樣品中待測病毒滴度對數(shù)值等于4.0;取病毒載體置于細(xì)胞培養(yǎng)板中，并進(jìn)行密封處理，再放入加速器輻照裝置內(nèi)腔內(nèi)。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)置不同輻照劑量梯度，輻照處理至相應(yīng)的時間取出。輻照后的樣品放入用10min,混勻洗脫。7.2滅活組和7.3對照組按照終點稀釋法分別進(jìn)行病毒滴度測定，試驗重復(fù)3次。具體步驟按照WS/T775—2021中載體制備和載體法滅活試驗。8病毒滅活有效性與最低有效輻照滅活劑量判定用細(xì)胞感染法測定輻照處理前后樣本中病毒的量，以病毒侵染后細(xì)胞病變作為判斷指標(biāo)。使用a)陰性對照組細(xì)胞生長正常；b)陽性對照組病毒滴度對數(shù)值應(yīng)≥4.0;滿足8.2有效性判定標(biāo)準(zhǔn)且病毒滴度對數(shù)值等于4.0對應(yīng)的輻照劑量最小值，即為最低有效輻照滅活劑量。4(規(guī)范性)輻照設(shè)備劑量標(biāo)定方法A.1劑量計采用B3薄膜劑量片。A.2.1分光光度計：能提供520nm光波波長；波長精度±2±0.5%(T)(SRM930D);透射比重復(fù)性0.3%(T);光譜帶寬6nm;雜光≤0.5%(T)(360nm,NaNO?)。A.2.4鑷子：用于夾取劑量片，防止其他拿取方式污染薄膜劑量片。A.3.1將一張A4紙平鋪在托盤上(公司提供的標(biāo)準(zhǔn)高度24mm托盤),要求紙張要與金屬托盤貼合A.3.2將紙張多余部分去除。標(biāo)注1個測量點(一側(cè)1個，共3個點)。如圖A.15托盤托盤劑量片圖A.2劑量片在托盤上的放置位置示意圖A.3.5劑量片放置好后需要對其進(jìn)行固定(設(shè)備在輻照時設(shè)備會通入氮氣，流動的氮氣會將輕薄的劑量片吹移位置)。固定方法是在劑量片的邊緣采用紙膠帶粘接固定。粘接固定需要固定在對角上的兩個點，同時需要注意劑量片要平貼在A4紙上。粘接方法如圖A.3所示。圖A.3劑量片紙膠帶粘接方法示意圖A.3.6劑量片固定好后邊可放入設(shè)備進(jìn)行劑量測量標(biāo)定。劑量點擊啟動。A.3.8輻照完成后將劑量片依次貼在紙上放入烘箱(烘箱溫度60℃)保溫15min,然后采用分光光度儀讀取參數(shù)δ。分光光度儀使在用前需要預(yù)熱30min。A.3.9在使用分光光度儀讀數(shù)前需要對儀器進(jìn)行校驗。首先打開電源開關(guān)等待30min預(yù)熱，預(yù)熱完成后按下述步驟操作：a)按“MODE”鍵進(jìn)入“T”擋；在完成上述操作就即可進(jìn)行劑量片讀數(shù)。6T/CIRA56—2023的參數(shù)δ做好記錄。然后用δ參數(shù)的劑量對照表讀取3個讀取參數(shù)δ1、δ2、0?分別所對應(yīng)的劑量讀數(shù)值記為D?、D?、D?。最后根據(jù)公式(A.1)計算輻照平均劑量D:通過分光光度儀測量的劑量讀數(shù)值。7T/CIRA56—2023[1]GB/T25306輻射加工用電子加速器工程通用規(guī)范[2]T/CIRA29—2022冷鏈?zhǔn)称繁砻娴男滦凸跔畈《緶缁顒┝恳骩3]WS588—2018手足口病診斷perimentPatholuPharmakol.1931;162:480-483[5]孫廷麗，韓玉茹，王青柏，等.噬菌體作為指示病毒的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].微